陳兆耀， 陳茂剛， 盧婷婷， 倪冠中， 劉新峰， 徐格林

(南京大學醫(yī)學院臨床學院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 江蘇 南京 210002)

谷氨酸致原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷中自噬的激活*

陳兆耀， 陳茂剛， 盧婷婷， 倪冠中， 劉新峰， 徐格林△

(南京大學醫(yī)學院臨床學院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 江蘇 南京 210002)

目的體外觀察谷氨酸介導的神經(jīng)元氧化性損傷中自噬的激活，以及抑制自噬對谷氨酸致神經(jīng)元毒性損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，給予谷氨酸以及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干預，MTT法檢測細胞活力，透射電鏡觀察自噬泡的產(chǎn)生，激光共聚焦顯微鏡觀察自噬特異性蛋白LC3的表達。結(jié)果給予谷氨酸干預后皮層神經(jīng)元細胞存活率下降，自噬體數(shù)目明顯增加，自噬標志性蛋白LC3表達增加。給予3-甲基腺嘌呤后，神經(jīng)元細胞存活率增加，細胞自噬水平下降。結(jié)論谷氨酸誘導的神經(jīng)元毒性損傷中存在自噬相關(guān)性細胞死亡，抑制自噬可能對谷氨酸毒性損傷有抑制作用，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤具有一定的神經(jīng)保護作用。

自吞噬作用； 3-甲基腺嘌呤； 神經(jīng)元； 谷氨酸

谷氨酸興奮性損傷與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如缺血性腦血管病、阿爾茨海默病等。在體外實驗中，細胞外谷氨酸濃度增加可抑制谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運體，使細胞內(nèi)谷胱甘肽減少，活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS) 聚集，進而導致細胞死亡。然而，谷氨酸導致神經(jīng)細胞毒性損傷的機制并不清楚，甚至互相矛盾。比如，研究發(fā)現(xiàn)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)可以減少谷氨酸介導的細胞死亡,說明凋亡在谷氨酸毒性損傷中起重要作用[1]，但是同時有研究指出谷氨酸介導的HT22細胞(一種海馬神經(jīng)元細胞株)毒性損傷中未見caspase-3的激活，抑制caspase亦未能提高細胞存活率，因此認為有非凋亡相關(guān)的機制參與了細胞的死亡[2]。

自噬是細胞內(nèi)長壽命蛋白的主要降解途徑，細胞外界環(huán)境刺激如饑餓、氧化損傷等可以激活Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸激酶 (class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase, ClassⅢ PI3K)和Beclin-1的復合物，該復合物募集自噬相關(guān)蛋白如輕鏈3蛋白(light chain 3, LC3)等形成自噬泡。自噬泡包裹大分子蛋白及細胞器，繼而與溶酶體融合完成蛋白及細胞器的降解[3]。因此自噬是有一定保護作用的，但同時自噬也參與細胞死亡，這與細胞種類不同以及干預方法不同有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注狀態(tài)下的氧化性損傷可以導致細胞自噬性死亡。目前認為自噬性死亡是不同于凋亡的另一種程序性死亡方式，或者稱之為Ⅱ型程序性細胞死亡，以自噬泡和自噬溶酶體的形成為特征。為了更好地研究谷氨酸對神經(jīng)元毒性損傷的機制，本研究檢測了谷氨酸處理后原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中自噬體的產(chǎn)生，自噬標志性蛋白LC3的表達變化，以及自噬對細胞存活的影響。

材 料 和 方 法

1材料

新生乳鼠(出生1 d以內(nèi))來自南京軍區(qū)總醫(yī)院動物中心，高糖Dulbecco必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s minimum essential medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、馬血清、neurobasal-A medium、B27、glutamax購自Gibco。多聚左旋賴氨酸(poly-l-lysine, PLL)、L-谷氨酸、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]、Hochest33258、3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine，3-MA)購自Sigma。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。試劑的配制：(1)種植液：DMEM 高糖培養(yǎng)80%，馬血清10%，胎牛血清10%;(2)培養(yǎng)液: Neurobasal-A TM 97 %，B27 2 %，谷氨酰胺1%(終濃度2 mmol/L)。谷氨酸與3-MA均溶于培養(yǎng)液中。

2大鼠皮層神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)

培養(yǎng)方法基本同前[4]，取新生24 h 內(nèi)的(Sprague Dawley, SD)乳鼠，75%乙醇浸泡消毒、斷頭處死，分層剪開頭皮和顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，取出鼠腦放置4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中，用顯微鑷分離雙側(cè)大腦皮層，除去腦膜和血管等組織，移入預冷至4℃的PBS解剖液中，剪碎為1 mm×1 mm1 mm的組織塊，0.125%的胰酶消化10 min，用含10%胎牛血清和10%馬血清的種植培養(yǎng)基終止消化，移入含種植培養(yǎng)基的離心管中，細口巴氏管輕輕吹打約20次，組織塊吹散后，靜置5 min，吸出上清液，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾入10 mL離心管中，巴氏管輕輕吹打10次左右制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)活細胞；調(diào)整懸液的細胞密度，按1×106細胞的密度接種于預先用L-多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)板中。置37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；12 h后用無血清培養(yǎng)液換全液1次，此后每隔3 d半量換液1次，取培養(yǎng)至10 d的神經(jīng)元用于接下來的實驗，分別給予不同濃度的谷氨酸(1.25、2.5、5、10 mmol/L)及自噬抑制劑3-MA(2.5、5、10 mmol/L)，而對照組僅給予細胞培養(yǎng)液。

3MTT法檢測細胞活力

培養(yǎng)神經(jīng)元于96孔板中，每孔細胞數(shù)約1×104個，給予不同濃度的谷氨酸及自噬抑制劑3-MA干預后終止培養(yǎng)，而對照組只加入細胞培養(yǎng)液。于96孔板中加入MTT(15 μL/well)，作用4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)，37 ℃孵育15 min，酶標儀570 nm處檢測吸光度A值，并轉(zhuǎn)換為細胞活力，對照組細胞活力設為100%，其余各組細胞活力以對照組為參照分別計算。加入自噬抑制劑3-MA的神經(jīng)元處理組采用相同的檢測方法。

4電鏡下觀察自噬體的形成

谷氨酸作用2 h后，用PBS小心清洗神經(jīng)元2次，收集細胞并離心。然后取離心后沉淀的細胞團塊用2.5%戊二醛固定。小心分割細胞團塊并在2%戊二醛中固定過夜。隨后用0.15 mol/L PBS洗3遍，1%四氧化鋨(osmic acid, OsO4)室溫固定2 h，48 ℃ 固定過夜。細胞用冷無水乙醇脫水，然后用環(huán)氧乙烷漂洗，包被于環(huán)氧樹脂中64 ℃ 過夜。切片后于透射電鏡下觀察(Hitachi, H600)。自噬體的計數(shù)方法基本同前[5]，簡言之，取200目銅網(wǎng)覆蓋于切片上，每隔10個網(wǎng)格取1個網(wǎng)格用于分析，每個網(wǎng)格取2個神經(jīng)元用于計算。計數(shù)平均每個神經(jīng)元中自噬體的數(shù)目。

5激光共聚焦顯微鏡檢測LC3免疫熒光

皮層神經(jīng)元細胞爬片，正常培養(yǎng)至10 d，給予谷氨酸及3-MA干預后取出玻片，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，3%牛血清白蛋白封閉1 h。加兔抗-LC3后4 ℃孵育過夜，PBS清洗后異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC)標記的羊抗兔IgG室溫作用2 h，90%甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察標記紅色熒光的LC3蛋白表達，對正常組、谷氨酸處理組及3-MA處理組分別隨機計數(shù)20個細胞，計數(shù)其中呈點狀聚集的LC3，并分析平均每個細胞中點狀聚集狀態(tài)LC3的數(shù)目。

6統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1自噬抑制劑3-MA使谷氨酸誘導的神經(jīng)元損傷減輕，存活率增加

給予谷氨酸(1.25、2.5、5、10 mmol/L，2 h)誘導神經(jīng)元損傷，見圖1，發(fā)現(xiàn)給予谷氨酸1.25 mmol/L作用2 h后即可造成神經(jīng)元損傷，細胞活力降至(92.4±2.1)%，隨著谷氨酸濃度增加，神經(jīng)元存活率逐漸下降，并呈濃度依賴性。與對照組比較，谷氨酸5 mmol/L作用2 h后，細胞活力為(61.1%±1.2%，n= 12，P< 0.01),見圖1 B、D，接近對照組細胞活力的50%，因此我們選用此濃度及時間用于接下來的實驗。單純給予自噬抑制劑3-MA(2.5、5、10 mmol/L)并未造成細胞活力下降(n=12，P> 0.05)，但是能顯著減少谷氨酸(5 mmol/L，2 h)造成的細胞損傷，3組細胞活力分別為(67.2±1.0)%、(75.3±2.9)%和(75.1±2.3)%，與谷氨酸組(60.5±1.2)%相比有顯著差異(P<0.01)，見圖1 C、E。

圖1谷氨酸的神經(jīng)毒性損傷及自噬抑制劑3-MA的神經(jīng)保護作用

2自噬體在谷氨酸誘導的神經(jīng)元細胞毒性損傷中的形成

氧化損傷導致的細胞死亡與自噬關(guān)系密切，自噬特征性的變化為自噬泡的形成以及與溶酶體的融合形成自噬溶酶體。自噬體在形成過程中有不同的表現(xiàn)形式，如圖2所示，自噬體形成特征性的雙層膜結(jié)構(gòu)，并包裹細胞質(zhì)及細胞器等，見圖2A。而降解階段的自噬體呈單層膜結(jié)構(gòu)，并包含降解的細胞內(nèi)成分，見圖2B。自噬體在對照組呈較低水平表達(3.8±0.9，n= 6)，給予谷氨酸處理后自噬體的數(shù)目較對照組明顯增加(10.2±1.2，n=6，P<0.01)。與谷氨酸組比較，給予自噬抑制劑3-MA后，自噬體數(shù)目減少(6.7±1.2，n= 6，P< 0.05)，并有顯著差異，見圖2D。

圖2自噬體的形成

3自噬特征性蛋白LC3的表達

以谷氨酸誘導細胞氧化性損傷，觀察自噬特異性蛋白LC3的表達，如圖3所示，在正常細胞中，自噬特異性蛋白LC3呈均勻的低水平表達，見圖3A，而細胞發(fā)生自噬后，LC3表達增加，并聚集呈斑點樣，見圖3B。圖3D表明，斑點狀LC3在正常細胞中為4.7±0.8，給予谷氨酸處理后LC3為13.2±1.5，自噬抑制劑3-MA干預組LC3為11.3±1.4，與谷氨酸處理組比較有顯著差異 (P<0.05)。

圖3激光共聚焦顯微鏡觀察自噬特異性蛋白LC3的表達

討 論

本研究證明在谷氨酸導致的神經(jīng)元損傷中存在自噬的激活，表現(xiàn)為自噬標志性結(jié)構(gòu)自噬體增加，自噬特異性蛋白LC3表達增加。說明自噬在谷氨酸導致的神經(jīng)元細胞死亡中起重要作用。而給予自噬抑制劑3-MA能減低自噬水平并減輕谷氨酸造成的神經(jīng)元損傷。

谷氨酸導致的神經(jīng)元損傷涉及多種機制。當細胞外谷氨酸濃度增加后，細胞膜上的谷氨酸受體被激活。從而導致鈣內(nèi)流和鈣超載[6]。進而各種分解酶被激活，活性氧簇聚集，線粒體跨膜電位逸散以及caspase激活等。最終導致細胞壞死或細胞凋亡[7，8]。

自噬在正常情況下作為一種降解細胞內(nèi)長壽命蛋白和大分子的機制，對細胞維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細胞存活是必須的。同時，自噬的過度激活會導致細胞死亡，比如缺血缺氧損傷，氧化應激導致活性氧簇的產(chǎn)生等都有自噬性細胞死亡[9，10]。

我們的研究顯示，在谷氨酸導致的神經(jīng)元早期損傷中自噬即被激活。透射電鏡下觀察到自噬體的產(chǎn)生以及線粒體的破壞。線粒體的破壞可能是自噬產(chǎn)生的重要因素。因為線粒體是細胞內(nèi)活性氧簇的重要來源，而活性氧簇可以激活自噬基因Atg4導致自噬的產(chǎn)生[11]，同時，鈣離子也可以從破壞的線粒體中流出，而不斷增加的鈣離子能激活鈣調(diào)蛋白酶依賴性激酶(calmodulin dependent kinase-β)也可以導致自噬的產(chǎn)生[12]。

ClassⅢ PI3K 可與Beclin-1形成復合物參與募集胞漿蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成[13]。3-MA是ClassⅢ PI3K特異性抑制劑。因此，3-MA可以通過抑制ClassⅢ PI3K和Beclin-1復合物的形成發(fā)揮抑制自噬的作用。在本實驗中，3-MA有效地降低自噬體的形成，可能與其降低ClassⅢ PI3K的活性，阻止自噬體膜的形成有關(guān)。

總之，自噬參與了谷氨酸導致的神經(jīng)元毒性損傷，自噬抑制劑3-MA對谷氨酸導致的神經(jīng)元損傷有一定的保護作用。但自噬在谷氨酸損傷中的產(chǎn)生機制及3-MA的作用尚有待于進一步研究。

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Autophagyisactivatedduringglutamicacid-inducedcorticalneuroninjury

CHEN Zhao-yao, CHEN Mao-gang, LU Ting-ting, NI Guan-zhong, LIU Xin-feng, XU Ge-lin

(DepartmentofNeurology,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,ClinicalSchoolofMedicalCollege,NanjingUniversity,Nanjing210002,China.E-mail:gelinxu@gmail.com)

AIM: To investigate whether autophagy is activated during glutamic acid-induced neuron injury and the possible neuroprotective effect of 3-methyl adenine(3-MA) (an autophagy inhibitor).METHODSGlutamic acid or 3-MA was added to the medium of cultured cortical neurons. Cell viability was measured by MTT assay. The formation of autophagosome was observed under transmission electron microscope. The marker protein light chain 3(LC3) for autophagy was detected by immunofluorescence assay and visualized under laser confocal microscope.RESULTSThe cell viability declined during glutamic acid treatment and the autophagosomes were increased. LC3, the marker protein of autophagy, also significantly increased. The autophagy level was lowered by 3-MA, and cell viability was increased.CONCLUSIONThe results suggest that autophagy is activated during glutamic acid treatment and inhibition of autophagy may have neuroprotective effect. The autophagy inhibitor 3-MA may be a potential neuroprotective agent.

Autophagocytosis; 3-methyl adenine; Neurons; Glutamic acid

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.012

1000-4718(2011)01-0062-05

2010-07-15

2010-10-26

國家自然科學基金資助項目(No.30870848)

△通訊作者 Tel: 025-84801861； E-mail: gelinxu@gmail.com