唐瓊蘭， 陳 瑞， 劉衛(wèi)平， 李海剛， 林敏玲， 何欣欣

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1病理科，2呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510120； 3四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，四川 成都 610041)

HIF-1α在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管生成中的作用及意義

唐瓊蘭1，3， 陳 瑞2△， 劉衛(wèi)平3， 李海剛1， 林敏玲1， 何欣欣1

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1病理科，2呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510120；3四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，四川 成都 610041)

目的研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管生成中的作用及意義。方法采用免疫組化法檢測50例人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的表達(dá)情況，用CD34單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，并計算腫瘤微血管密度(MVD)，用SPSS 13.0軟件分析HIF-1α與VEGF、VEGFR2及腫瘤MVD的相關(guān)性。結(jié)果(1)50例中有39例(78%)腫瘤細(xì)胞HIF-1α陽性，27例(54%)VEGFR2陽性，與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況比較均有顯著差異(P<0.05)；(2)HIF-1α蛋白陽性表達(dá)組VEGF和VEGFR2的陽性表達(dá)率分別為72%和64%，明顯高于HIF-1α蛋白陰性表達(dá)組(P<0.05)；(3)HIF-1α、VEGFR和VEGFR2蛋白表達(dá)與腫瘤MVD相關(guān)(P<0.01)；(4)15例伴有血管中心性浸潤的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例均表達(dá)HIF-1α。結(jié)論HIF-1α可促進(jìn)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤血管生成，其作用機(jī)制可能與VEGF/VEGFR2通路有關(guān)。

淋巴瘤; 自然殺傷/T細(xì)胞; 缺氧誘導(dǎo)因子 1α; 血管生成

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤(extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為的侵襲性淋巴瘤，該腫瘤細(xì)胞常表達(dá)T細(xì)胞分化抗原及自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞相關(guān)抗原，故得此名[1，2]。結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲尤其在中國發(fā)病率較高，歐洲和北美地區(qū)少見[1，2]，多發(fā)生于結(jié)外器官或組織，具有血管破壞性和血管中心性浸潤的特點，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。課題組研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能與該腫瘤血管生成及預(yù)后有關(guān)[3]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α( hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)可調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄活性，與多種淋巴瘤血管生成有關(guān)[4-6]。目前尚未見有關(guān)HIF-1α與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管生成的報道。因此，本研究采用免疫組化法檢測50例人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例HIF-1α、VEGF和血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)的表達(dá)，分析HIF-1α與VEGF、VEGFR2及腫瘤微血管密度(microvessel density， MVD)的相關(guān)性，初步探討HIF-1α在結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管生成中的作用及臨床意義。

材 料 和 方 法

1病例資料

收集中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院2000年1月-2010年1月外檢診斷的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例60例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照新版WHO關(guān)于淋巴造血組織腫瘤分類(2008)[1]進(jìn)行，排除病變組織太少者10例，其余50例被納入本研究。本組病例年齡16-67歲，中位年齡38歲；男性30例，女性20例。首發(fā)部位以鼻腔最多見(23/50，46%)，其次為咽(12/50，24%)、硬腭(3/50，6%)、軟腭(3/50,6%)及上頜竇、扁桃體、會厭、頜下、肺、胃、小腸、結(jié)腸和睪丸(各1例，18%)。15例可見血管中心性浸潤。

2材料與試劑

HIF-1α鼠抗人單克隆抗體(SC-53546)和VEGFR2鼠抗人單克隆抗體(SC-6251)均購自Santa Cruz Biotech；VEGF(ZM-0265)和鏈親和素-過氧化物酶( streptavidin-biotin immunoperoxidase, SP)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CD34(GM716510)購自基因有限公司。

3方法

采用SP法。HIF-1α、VEGF、VEGFR2和CD34抗體的工作稀釋度分別為1∶50、1∶100、1∶80和1∶50?？乖迯?fù)方法參照試劑說明書進(jìn)行。以乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織為陽性對照，以PBS代替Ⅰ抗作為空白對照。

以同期10例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生標(biāo)本為對照比較淋巴造血組織良、惡性病變中HIF-1α、VEGF和VEGFR2表達(dá)情況。

4結(jié)果判定

HIF-1α、VEGF和VEGFR2結(jié)果判定方法: HIF-1α以細(xì)胞核或細(xì)胞核及部分胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色為陽性，VEGF和VEGFR2均以胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色為陽性；隨機(jī)選擇5個高倍(×400)視野，合并計算所分析的5個不同視野染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度，根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率及顯色深淺計分：(1)陽性細(xì)胞的百分率:陽性細(xì)胞率0-5%計0分；6%-25%計1分；26%-50%計2分；≥51%計3分。(2)顯色深淺:不顯色或顯色不清楚計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；深褐色計3分。以陽性細(xì)胞的百分率及顯色深淺評分之和3-6分為陽性。

CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜棕黃色為陽性。參照文獻(xiàn)[7]介紹方法對CD34染色切片進(jìn)行觀察，計算MVD。

5統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1HIF-1α、VEGF及VEGFR2在腫瘤細(xì)胞及正常淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

實驗組50例結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例中，39例(78%)腫瘤細(xì)胞表達(dá)HIF-1α(圖1A)，3例(3/10，30%)淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織呈陽性表達(dá)(淋巴濾泡生發(fā)中心少數(shù)B細(xì)胞和漿細(xì)胞呈弱陽性表達(dá))，兩組比較，2= 9.143，P<0.01，差異顯著。32例(64%)腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF(圖1B)，與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況比較，2= 0.057，P>0.05，無顯著差異。27例(54%)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGFR2(圖1C)，淋巴結(jié)內(nèi)正常淋巴細(xì)胞VEGFR2呈陰性或極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)，2=6.482，P<0.05,見表1。

表1HIF-1α、VEGF及VEGFR2在腫瘤細(xì)胞及正常淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

Table 1. The expression of HIF-1α, VEGF and VEGFR2 in tumor cells of extranodal nasal type NK/T-cell lymphomas and normal lymphocytes of lymph nodes

GroupHIF-1αVEGFVEGFR2nPositiveNegativenPositiveNegativenPositiveNegativeNK/T-celllymphomas5039(78%)115032(64%)185027(54%)23Normallymphocytes103(30%)7106(60%)4101(10%)9

2HIF-1α表達(dá)與VEGF、VEGFR2的關(guān)系

在人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例腫瘤細(xì)胞中, HIF-1α蛋白陽性表達(dá)組VEGF和VEGFR2的陽性表達(dá)率分別為72%和64%，與HIF-1α蛋白陰性表達(dá)組比較，2= 4.675，P<0.05及2= 7.284，P<0.01，差異顯著。VEGF蛋白陽性表達(dá)組VEGFR2的陽性表達(dá)率為75%，與VEGF蛋白陰性表達(dá)組比較，2= 15.781，P<0.01，差異顯著，見表2。

表2HIF-1α與VEGF、VEGFR2及腫瘤MVD的相關(guān)性

Table 2. The correlative analysis between the expression of HIF-1α and VEGF, VEGFR2 and MVD in human extranodal nasal type NK/T-cell lymphomas

GroupVEGFVEGFR2MVD(x±s)nPositiveNegativenPositiveNegativeHIF-1α(positive)3928(72%)113925(64%)1435．8±5．4??HIF-1α(negative)114(36%)7112(18%)927．0±6．5VEGF(positive)3224(75%)837．0±4．5??VEGF(negative)183(17%)1528．1±7．4VEGFR2(positive)41．6±5．3??VEGFR2(negative)24．7±6．4

**P<0.01vscorresponding negative group.

3HIF-1α、VEGF和VEGFR2表達(dá)與腫瘤MVD的關(guān)系

HIF-1α蛋白陽性表達(dá)組MVD最低為11.3，最高為55.8，平均為35.8，HIF-1α蛋白陰性表達(dá)組MVD最低為5.6，最高為34.2，平均為27.0，兩組比較，差異顯著(P<0.01)，說明HIF-1α蛋白表達(dá)水平高者M(jìn)VD大，HIF-1α蛋白表達(dá)與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤血管形成有關(guān)，見表2。

VEGF蛋白陽性表達(dá)組MVD最低為5.6，最高為55.8，平均為37.0，與VEGF蛋白陰性表達(dá)組比較，差異顯著(P<0.01)；VEGFR2蛋白陽性表達(dá)組MVD最低為9.5，最高為55.8，平均為41.6，與VEGFR2蛋白陰性表達(dá)組比較，差異顯著(P<0.01)，說明VEGF和VEGFR2可能具有促進(jìn)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤血管形成的作用。

4HIF-1α、VEGF和VEGFR2表達(dá)與血管中心性浸潤的關(guān)系

15例伴有血管中心性浸潤的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例均表達(dá)HIF-1α，無血管浸潤者HIF-1α陽性率為69%，兩組比較，差異顯著。13例表達(dá)VEGF和12例表達(dá)VEGFR2，與無血管中心性侵潤病例比較，P<0.05，差異顯著。結(jié)果說明，HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管中心性浸潤有關(guān)。

表3 HIF-1α、VEGF及VEGFR2與血管中心性浸潤的關(guān)系

Figure 1. HIF-1α, VEGF, VEGFR2 and CD34 expression in the tumor tissues of human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma (SP, ×200 ).A: HIF-1α; B: VEGF; C: VEGFR2; D: CD34.

圖1結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中HIF-1α、VEGF、VEGFR2及CD34的表達(dá)

討 論

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲及南美洲地區(qū)多見，據(jù)不完全統(tǒng)計，在不同地區(qū)，該腫瘤在所診斷的淋巴瘤中占的比例分別為：西方國家0.17%，北京7%，香港13%，廣州7%，成都18%，該類腫瘤可謂是中國的“特產(chǎn)”之一[2，8]。近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著我國青壯年人口的生命。因此，加強(qiáng)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制研究，積極尋求針對該類疾病的特異性治療方案是目前防治該類腫瘤的當(dāng)務(wù)之急。

缺氧是實體腫瘤的普遍特征，腫瘤缺氧促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲生長和對化、放療的抵抗作用。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是應(yīng)答缺氧的關(guān)鍵調(diào)控基因，它的活性與腫瘤血管生成密切相關(guān)[9]。HIF-1α還能增強(qiáng)其下游靶基因的表達(dá)，其中VEGF及其受體編碼基因是HIF-1α最主要的靶基因。VEGF是目前已知專屬性最強(qiáng)的血管生成因子，通過與其受體VEGFR2結(jié)合激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血管生成，并增加血管通透性，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[9,10]。Skinner等[11]發(fā)現(xiàn)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性可由HIF-1α、HDM2 和p70S6K1在PI3K/Akt信號中調(diào)節(jié)的, HIF-1α的表達(dá)通過活化PI3K/Akt信號通路在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)VEGF蛋白的表達(dá),而HDM2和p70S6K1是Akt下游的兩個生長因子，能增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性和HIF-1α的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF及其受體VEGFR2在多種淋巴瘤中廣泛表達(dá)[3-7，10]，并與多種淋巴瘤預(yù)后有關(guān)。Evens等[12]研究發(fā)現(xiàn)：高度惡性非霍奇金淋巴瘤中HIF-1α陽性表達(dá)率明顯高于低度惡性非霍奇金淋巴瘤，這可能與腫瘤的生長速度及血管形成有關(guān)，腫瘤的生長速度越快，缺氧越嚴(yán)重，缺氧引起腫瘤細(xì)胞內(nèi) HIF-1α 蛋白的積聚和核轉(zhuǎn)位，結(jié)合于 VEGF的啟動子區(qū)域的低氧反應(yīng)元件(HRE)從而激活 VEGF的轉(zhuǎn)錄，激活VGEF/VEGFR2信號通路，促進(jìn)腫瘤血管形成及微血管密度增加，VEGF和VEGFR2結(jié)合并激活后將細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)激酶級聯(lián)反應(yīng)信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞的一系列變化，包括內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移、增殖、存活，最終導(dǎo)致新生血管形成[9,10]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中HIF-1α陽性率為78%，而反應(yīng)性增生淋巴組織中僅有少數(shù)正常淋巴細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。研究結(jié)果提示：HIF-1α表達(dá)上調(diào)可能是淋巴瘤發(fā)生的重要分子事件。

本研究在對50例結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)：結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例腫瘤細(xì)胞HIF-1α、VEGF和VEGFR2陽性表達(dá)率高，而淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞HIF-1α和VEGFR2呈陰性或極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)。HIF-1α蛋白陽性表達(dá)組VEGF和VEGFR2的陽性表達(dá)率分別為72%和64%。HIF-1α與VEGF/VEGFR2有關(guān)。15例伴有血管中心性浸潤的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例均表達(dá)HIF-1α，而且HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血管中心性浸潤有關(guān)。同時研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白陽性表達(dá)組微血管密度較對照組高，差異顯著。上述結(jié)果顯示：HIF-1α與結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤獨特的生物學(xué)行為有關(guān)，可促進(jìn)結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤血管生成，其作用機(jī)制可能與VEGF/VEGFR2通路有關(guān)。

缺氧是淋巴瘤的基本特征，在其乏氧應(yīng)答過程中，HIF-1α的活化處于中心地位，故通過調(diào)節(jié)人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤HIF-1α的活性，可以降低VEGF的轉(zhuǎn)錄水平而抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移；同時通過抑制乏氧細(xì)胞來提高淋巴瘤腫瘤細(xì)胞對放、化療的敏感性。因此，深入研究HIF-1α在人結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的調(diào)節(jié)機(jī)制有助于開拓新的腫瘤治療思路。

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AngiogeniceffectofHIF-1αonextranodalnasal-typeNK/T-celllymphoma

TANG Qiong-lan1,3, CHEN Rui2, LIU Wei-ping3, LI Hai-gang1, LIN Min-ling1, HE Xin-xin1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofRespiratoryDiseases,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofPathology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China.E-mail:gzchenrui@163.com)

AIM: To study the angiogenic effect of hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α) and its significance on human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma.METHODSThe protein levels of HIF-1α, vascular endothelial growth factor(VEGF) and VEGF receptor 2(VEGFR2) in human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma were detected by immunohistochemistry. Microvessel density (MVD) of the tumor tissues was determined by labeling of microvessel endothelium with CD34 antibody. The correlation between the expression of HIF-1α, VEGF and VEGFR2 and MVD was analyzed with SPSS 13.0 statistical software.RESULTSThe positive expression of HIF-1α was observed in 39 cases (39/50, 78%) and the positive expression of VEGFR2 was 27 cases (27/50, 54%) of human extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma. A statistical difference of HIF-1α and VEGFR2 expression between tumor tissues and normal lymphocytes in lymph node was observed (P<0.05). In the tumor tissues, the co-expression of VEGF or VEGFR2 with HIF-1α was 72% and 64%, respectively, significantly higher than that without HIF-1α co-expression (P<0.05). The expression of HIF-1α, VEGFR and VEGFR2 was positively correlated with MVD of the tumor tissues (P<0.01). HIF-1α was expressed in all 15 cases of extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma with angiocentric infiltration.CONCLUSIONHIF-1α may promote angiogenesis of extranodal nasal-type NK/T-cell lymphoma through VEGF/VEGFR2 signaling pathway.

Lymphoma; Natural killer/T-cell; Hypoxia inducible factor 1α; Angiogenesis

R736.1

A

1000-4718(2011)03-0518-05

2010-08-27

2011-01-17

△ 通訊作者Tel: 020-81332590; E-mail: gzchenrui@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.019