李志斐,謝 駿,龔?fù)麑?余德光,王廣軍,唐小江(.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 廣東5080；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 2006；.廣東省職業(yè)病防治院,廣州 廣東 5000)

三甲基氯化錫對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)

李志斐1,2,謝 駿1*,龔?fù)麑?,余德光1,王廣軍1,唐小江3(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣州 廣東510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306；3.廣東省職業(yè)病防治院,廣州 廣東 510300)

研究了三甲基氯化錫(TMT)對(duì)蛋白核小球藻、大型溞和斑馬魚(yú)的急性毒性影響.結(jié)果表明,TMT在實(shí)驗(yàn)濃度下,對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)有抑制作用,濃度越高抑制作用越明顯.較高濃度組(5.31,20mg/L)可致死部分蛋白核小球藻細(xì)胞,TMT對(duì)蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對(duì)大型溞的 48h-LC50為 0.087mg/L,也屬于極高毒性;TMT對(duì)斑馬魚(yú)的 96h-LC50為 2.45mg/L,屬于高毒性.TMT對(duì)這3種水生生物的抑制率/致死率(EC50/LC50)隨時(shí)間呈規(guī)律性變化.TMT的神經(jīng)毒性和親脂特性可能是其對(duì)水生生物較高毒性的主要原因.

TMT；毒性；蛋白核小球藻；大型溞；斑馬魚(yú)

三甲基氯化錫(TMT)是一種重要的有機(jī)錫化合物,廣泛用于工業(yè)塑料熱穩(wěn)定劑中.隨著塑料工業(yè)及二手塑料再加工的迅速發(fā)展,TMT會(huì)隨生產(chǎn)廢水、地表徑流等途徑進(jìn)入水環(huán)境中,TMT也曾用于化學(xué)消毒劑和殺菌滅蟲(chóng)劑,且 TMT在塑料中的濃度高達(dá)8.5～24.9mg/kg[1].TMT具有很好的親水性和親脂性[2-3],極易通過(guò)消化和皮膚黏膜進(jìn)入機(jī)體,對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性并在體內(nèi)富集[4-6].在海洋、江河、水庫(kù)、地下水、水生生物機(jī)體內(nèi)等均發(fā)現(xiàn) TMT的存在[7-9],因此極有可能對(duì)水生生物造成潛在危害.

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于TMT對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)研究多集中在TMT的神經(jīng)效應(yīng)及生物累積性等方面,如Wang等[10]就TMT對(duì)褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus)腦神經(jīng)效應(yīng)進(jìn)行了報(bào)道,Hadjispyrou等[5]就鹵蟲(chóng)對(duì)TMT的富集進(jìn)行了報(bào)道.而對(duì)其進(jìn)入水環(huán)境后對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)并不多,因此本研究以水生生物中 3大營(yíng)養(yǎng)級(jí)上的代表生物(蛋白核小球藻(Chlorelapyrenoidosa)、大型溞(Daphnia magna)和斑馬魚(yú)(Danio rerio))為實(shí)驗(yàn)材料,研究了TMT對(duì)三種不同水生生物的急性毒性,旨在判斷其對(duì)水生生物可能造成的危害,為有關(guān)水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù),并為相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白核小球藻購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù), BG11培養(yǎng);大型溞取自河北大學(xué)生物修復(fù)技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室,參照大型溞測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法[11]進(jìn)行飼養(yǎng),經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)后使其保持在孤雌生殖狀態(tài);斑馬魚(yú)(AB系)來(lái)自廣州市花地灣市場(chǎng),為當(dāng)年生、同一批次斑馬魚(yú),平均體長(zhǎng)(2.4±0.2)cm,馴養(yǎng)2周以上,自然死亡率＜1%.

三甲基氯化錫購(gòu)自美國(guó)Acres organics公司,常溫下為白色結(jié)晶狀物質(zhì),純度＞99%.

1.2 藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確定TMT的濃度范圍為 0.1～20mg/L,按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)濃度和1個(gè)對(duì)照組,每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣.在500mL三角瓶中加入20mL藻(處于對(duì)數(shù)同步生長(zhǎng)期)試驗(yàn)液,分別添加30mL不同濃度TMT溶液,溶液終體積 200mL,混合溶液蛋白核小球藻的初始接種密度為5×105個(gè)/mL.培養(yǎng)條件: pH7.6,溫度(24±1),℃光強(qiáng)為4000lx,光暗比為l4h∶10h,每天定期搖動(dòng)藻液 3 次,每次 10min.所用玻璃器皿和培養(yǎng)液均經(jīng)過(guò) 121℃、25min滅菌.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到0,24,48,72,96h定時(shí)取樣用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度,每次取樣相對(duì)偏差＜10%.

[13]以對(duì)照組的平均值作對(duì)照,求各個(gè)濃度組的抑制率,采用機(jī)率單位法計(jì)算各時(shí)間的 EC50及相關(guān)方程.EC50值計(jì)算步驟為,先通過(guò)查表,將蛋白核小球藻的抑制速率換算成概率單位,然后將 TMT濃度對(duì)數(shù)與概率單位進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸,得到TMT對(duì)小球藻的劑量-反應(yīng)方程,當(dāng)概率單位為 5時(shí),通過(guò)回歸方程計(jì)算EC50值.

1.3 大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)

參照大型溞測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法[11]進(jìn)行.大型溞為本實(shí)驗(yàn)連續(xù)培養(yǎng) 3代以上的單克隆品系.根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果,確定 TMT的濃度范圍為 0.05～0.50mg/L,按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置11個(gè)TMT的試驗(yàn)濃度和一個(gè)對(duì)照組,每次試驗(yàn)設(shè)4個(gè)平行樣,結(jié)果取4組平均值.在100mL燒杯內(nèi)加入50mL設(shè)定濃度的 TMT溶液和 10只(溞齡＜24h)幼溞,用保鮮膜封口以減少蒸發(fā).試驗(yàn)水溫為(23±1),℃pH7.6,24h光照黑暗循環(huán),光照強(qiáng)度 2000lx,靜置培養(yǎng).分別在24,48h觀察記錄大型溞的中毒及死亡狀況.轉(zhuǎn)動(dòng)試驗(yàn)燒杯,15s內(nèi)活動(dòng)距離不超過(guò)本身的長(zhǎng)度,即認(rèn)為大型溞活動(dòng)受到抑制,即使觸角仍在擺動(dòng)的大型溞,也認(rèn)為是受抑制的個(gè)體.大型溞的死亡以其心臟停止跳動(dòng)為標(biāo)志[13].采用機(jī)率單位法計(jì)算各時(shí)間的半數(shù)致死濃度(LC50)和半效應(yīng)濃度(EC50)及相關(guān)方程[13].

1.4 斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)

參照標(biāo)準(zhǔn)方法[14]進(jìn)行.在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上得出的濃度范圍 1.6～10mg/L.設(shè)置 17個(gè)濃度梯度,同時(shí)以空白為對(duì)照,均設(shè)4個(gè)平行.結(jié)果取4組平均值.在每一試驗(yàn)濃度組和對(duì)照試驗(yàn)組容器隨機(jī)放入10尾斑馬魚(yú).每24h更換試驗(yàn)液1/2,試驗(yàn)水溫為(23±1)℃,pH7.6,自然光照,靜置培養(yǎng),試驗(yàn)期間不投放餌料.于 24,48,72,96h觀察記錄斑馬魚(yú)的中毒及死亡情況,以沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的活動(dòng)、鰓的翕動(dòng)停止及觸碰尾部無(wú)反應(yīng)為斑馬魚(yú)死亡標(biāo)準(zhǔn),采用機(jī)率單位法[13]計(jì)算各時(shí)間的LC50及相關(guān)方程.

2 結(jié)果與分析

2.1 TMT對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

從蛋白核小球藻 96h生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果可看出(圖1),蛋白核小球藻在TMT中生長(zhǎng)受到一定的抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.在整個(gè)生長(zhǎng)試驗(yàn)過(guò)程中,0.1,0.38和1.41mg/L處理下蛋白核小球藻生長(zhǎng)受到抑制,生長(zhǎng)緩慢,5.31mg/L處理為零增長(zhǎng);20mg/L處理則表現(xiàn)為很強(qiáng)的抑制作用,蛋白核小球藻長(zhǎng)勢(shì)從試驗(yàn)開(kāi)始就下降直至實(shí)驗(yàn)液逐漸透明.顯微鏡觀察到藻體開(kāi)始分解,大量藻細(xì)胞死亡.直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束 96h時(shí),0.1,0.38,1.41,5.31和20mg/L濃度組與96h對(duì)照組相比抑制率分別為34%,48%,58%,77%和92%.

圖1 TMT對(duì)蛋白核小球藻的毒性曲線(xiàn)Fig.1 Toxicity curve of TMT for Chlorela pyrenoidosa

通過(guò)機(jī)率單位法計(jì)算出的不同時(shí)間的劑量效應(yīng)方程(表 1)可知,TMT對(duì)蛋白核小球藻急性毒性試驗(yàn)的各方程相關(guān)系數(shù)為0.9671～0.9937,具有較好的線(xiàn)性相關(guān)性,表明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠.根據(jù)各相關(guān)方程求出 TMT對(duì)蛋白核小球藻24,48,72及96h的EC50值分別為0.46,1.27,5.36和 20.9mg/L.按照水生生物毒性分級(jí)[15],TMT屬于極高毒性.

表1 TMT對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性影響Table 1 The acute toxicity of TMT on Chlorela pyrenoidosa

2.2 TMT對(duì)大型溞的急性毒性影響

從大型溞48h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果可看出(圖2),TMT對(duì)大型溞的活動(dòng)產(chǎn)生了明顯的抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和 TMT濃度增加,大型溞的死亡率和抑制率逐漸增加.當(dāng) TMT濃度為 0.05mg/L時(shí),48h對(duì)大型溞活動(dòng)產(chǎn)生部分抑制,但無(wú)死亡現(xiàn)象;當(dāng)TMT濃度為0.185mg/L時(shí),24h大型溞的死亡率為60%,抑制率為80%,48h大型溞的死亡率已升到100%.

根據(jù)相關(guān)方程求得 TMT對(duì)大型溞的 24h,48h的 LC50分別為 0.150,0.087mg/L;24h,48h的EC50分別為 0.113,0.063mg/L.參照有關(guān)毒性分級(jí)[13],TMT對(duì)大型溞的毒性屬極高毒性.

圖2 TMT對(duì)大型溞的毒性曲線(xiàn)Fig.2 Toxicity curve of TMT for Daphnia magna

表2 TMT對(duì)大型溞的急性毒性影響Table 2 The acute toxicity of TMT on Daphnia magna

2.3 TMT對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性影響

圖3 TMT 對(duì)斑馬魚(yú)的毒性曲線(xiàn)Fig.3 Toxicity curve of TMT for Danio rerio

從斑馬魚(yú)96h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果可看出(圖3),TMT對(duì)斑馬魚(yú)的存活產(chǎn)生了明顯抑制,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系.隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)和 TMT濃度增加,斑馬魚(yú)的死亡率逐漸增加.24h的死亡劑量數(shù)據(jù)與48h,72h,96h的相差較大,當(dāng)TMT濃度處于2～4.5mg/L之間,24h內(nèi)對(duì)斑馬魚(yú)的死亡率沒(méi)有明顯的影響,而48h,72h和96h的死亡率處于急劇上升的趨勢(shì),可以看出 TMT對(duì)斑馬魚(yú)毒性與時(shí)間具有較高的相關(guān)性.

根據(jù)相關(guān)方程求得 TMT對(duì)斑馬魚(yú)的 24h,48h,72h及 96h的 LC50分別為 7.36,4.13,3.06,2.45mg/L;參照有關(guān)毒性分級(jí)[13],TMT對(duì)斑馬魚(yú)的毒性屬高毒性.

表3 TMT對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性影響Table 3 The acute toxicity of TMT on Danio rerio

3 討論

3.1 TMT對(duì)3種水生生物毒性效應(yīng)的比較

TMT對(duì)蛋白核小球藻的 96h-EC50為0.46mg/L;對(duì)大型溞的 24h-LC50、48h-LC50分別為 0.150和 0.087mg/L;對(duì)斑馬魚(yú) 96h-LC50為2.45mg/L.根據(jù)有關(guān)毒性分級(jí)[13],TMT對(duì)3種水生生物的毒性較高,小球藻和大型溞屬于極高毒,斑馬魚(yú)屬高毒.Nagase等[16]報(bào)道的 TMT對(duì)青鳉的LC50為 5.62mg/L;Hadjispyrou等[5]和 Vighi等[17]報(bào)道的TMT對(duì)鹵蟲(chóng)和大型溞的24h-LC50分別為0.22mg/L和0.48mg/L;以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合.而Wong等[18]報(bào)道的TMT對(duì)鐮形纖維藻的EC50為5.5mg/L,與小球藻相差較大,這可能是藻種類(lèi)不同的原因.

就敏感性而言,一般認(rèn)為,有機(jī)錫化合物對(duì)藻類(lèi)敏感性強(qiáng)于水蚤,王珊珊等[19]利用斜生柵藻和大型溞測(cè)定 4種丁基錫的毒性時(shí)卻發(fā)現(xiàn)藻的敏感性明顯高于水蚤.根據(jù)文獻(xiàn)[20-22]發(fā)現(xiàn)三苯基錫對(duì)藻(扁藻、金藻、新月菱形藻和三角褐指藻)的96h-EC50為 1～7μg/L,對(duì)大型溞的 24h-EC50為13.33μg/L,即藻敏感性略高于水蚤.本實(shí)驗(yàn)中,以小球藻 96h-EC50、大型溞 48h-LC50和斑馬魚(yú)96h-LC50作為 TMT毒性測(cè)試指標(biāo),可以看出水中不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物對(duì)TMT的敏感性存在差異大型溞的敏感性最強(qiáng),蛋白核小球藻和斑馬魚(yú)次之.其規(guī)律同大多數(shù)水生生物毒性測(cè)試相似[23],而與大多數(shù)有機(jī)錫化合物對(duì)藻和水蚤的敏感性不同.可見(jiàn),藻類(lèi)和水蚤對(duì)不同有機(jī)錫的敏感性有顯著差異,這與生物本身的生理特點(diǎn)有關(guān),也與不同有機(jī)錫的選擇特異性有關(guān).大型溞的毒性效應(yīng)最強(qiáng),可能與大型溞表面的疏水性以及 TMT的親脂性和較高的神經(jīng)毒性[24]有關(guān).

對(duì)不同生物的毒性差異表明,建立在食物鏈層次上的綜合水生生態(tài)毒性試驗(yàn)結(jié)果,有助于更加全面系統(tǒng)地了解有機(jī)錫進(jìn)入水環(huán)境后的生態(tài)后果[25].

3.2 TMT的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)

根據(jù)歐盟化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)技術(shù)指南(TGD)[26]的商值法對(duì)自然水體中的TMT進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià).評(píng)價(jià)方法為:首先用3個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)水平(藻、溞、魚(yú))急性毒性試驗(yàn) EC50/LC50值與評(píng)價(jià)系數(shù)(1000)之比預(yù)測(cè)出無(wú)影響濃度(PNEC),再用化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境濃度(PEC)與PNEC的比值得到風(fēng)險(xiǎn)表征,進(jìn)而評(píng)判化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境安全性.其中風(fēng)險(xiǎn)表征(PEC/PNEC)＞1時(shí),意味著化學(xué)物質(zhì)對(duì)其周邊水體的生物構(gòu)成了風(fēng)險(xiǎn).根據(jù)歐盟評(píng)價(jià)方法和本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出TMT對(duì)3個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的無(wú)影響濃度如下:藻(PNEC)為 0.46μg/L;溞(PNEC)為 0.087μg/L;魚(yú)(PNEC)為 2.45μg/L.以最低值0.087μg/L作為 TMT對(duì)水生生物的無(wú)影響濃度.Shawky等[7]對(duì)德國(guó)北海和易北河水體研究顯示TMT含量在2～11ng/L.Liu等[8]對(duì)北京官?gòu)d水庫(kù)和永定河水體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn) TMT含量高達(dá)0.36μg/L.邱士起等[9]對(duì)珠海市某工業(yè)區(qū)地下水進(jìn)行調(diào)查,能檢出 TMT含量竟高達(dá) 0.107mg/L.可以看出,已超過(guò)實(shí)驗(yàn)研究的無(wú)影響濃度,檢出的TMT其水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不可忽視.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5],TMT具有顯著的生物積累性,鹵蟲(chóng)體內(nèi)的含量為水中含量的75倍,TMT還可以和其他污染物(重金屬等)結(jié)合具有協(xié)同作用增加毒性作用.因此,即使水中 TMT含量不高,不會(huì)產(chǎn)生急性毒性,但也存在著通過(guò)生物蓄積和食物鏈傳遞而危及人類(lèi)的潛在風(fēng)險(xiǎn).隨著有機(jī)錫熱穩(wěn)定劑的大量使用,TMT在中國(guó)水體環(huán)境中的污染面將不斷擴(kuò)大并對(duì)水生生物乃至人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在的威脅.

4 結(jié)論

4.1 TMT對(duì)于3種不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的水生生物均有很強(qiáng)的毒性,TMT對(duì)蛋白核小球藻的 96h-EC50為 0.46mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對(duì)大型溞的48h-LC50為0.087mg/L,屬于極高毒物質(zhì);TMT對(duì)斑馬魚(yú)96h-LC50為2.45mg/L,屬于高毒物質(zhì).且3種水生生物死亡及抑制效應(yīng)均與TMT的濃度顯著相關(guān),呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

4.2 不同物種對(duì)本次研究的兩種藥物敏感程度不同.本次研究中,大型溞對(duì)于TMT最敏感,蛋白核小球藻次之,斑馬魚(yú)最弱.

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Toxicity effect of Trimethyltin chloride on aquatic organisms.

LI Zhi-fei1,2, XIE Jun1*, GONG Wang-bao1, YU De-guang1, WANG Guang-jun1, TANG Xiao-jiang3(1.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China；2.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3.Guangdong Prevention and Treatment Center Occupational Diseases, Guangzhou 510300,China). China Environmental Science, 2011,31(4)：642～646

A study was carried out on the acute toxicity effects of Trimethyltin chloride (TMT) on Chlorela pyrenoidosa,Daphnia magna and Danio rerio. The results suggested that the growth of Chlorela pyrenoidosa was inhibited in the TMT of experimental content, the inhibiting effect increased significantly with the concentration increasing. The part of Chlorela pyrenoidosa cells even would be lethal in the higher concentration group(5.31,20mg/L).The toxic effects of TMT had the highest toxicity to Chlorela pyrenoidosa and Daphnia magna, and the 96h-EC50and 48h-LC50was 0.46mg/L and 0.087mg/L, respectively. while was high-toxic to Danio rerio, the 96h-LC50concentration was 2.45mg/L. EC50/LC50changed regularly with the test time. The two main reasons leading to the potential threat to the aquatic organisms could be the neurotoxicity and lipophilic property of TMT.

TMT；toxicity；Chlorela pyrenoidosa；Daphnia magna；Danio rerio

X503.2

A

1000-6923(2011)04-0642-05

2010-08-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(nycytx-49-13)廣東省海洋漁業(yè)科技推廣項(xiàng)目(A200901D04);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771786)

* 責(zé)任作者, 研究員, xiejunhy@yahoo.com.cn

李志斐(1983-),男,河南安陽(yáng)人,上海海洋大學(xué)碩士研究生,主要從事生態(tài)環(huán)境毒理學(xué)研究.