張俊生，陳莉華*，張文龍

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

湘西節(jié)節(jié)草總黃酮的超聲波提取及抗氧化研究

張俊生，陳莉華*，張文龍

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

以湘西蕨類植物節(jié)節(jié)草為原料，采用超聲波輔助法提取總黃酮。通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，考察總黃酮對(duì)羥自由基的清除效果及在不同時(shí)間、溫度下對(duì)油脂的抗氧化性能。結(jié)果表明，當(dāng)在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、料液比1:30 (g/mL)、超聲提取時(shí)間30min、超聲溫度60℃最佳條件下，節(jié)節(jié)草中總黃酮得率為1.16%。該黃酮提取物對(duì)羥自由基清除效果隨濃度的增大而升高，對(duì)茶籽油的抗氧化效果較動(dòng)物油脂好。

節(jié)節(jié)草；黃酮；提取；油脂；抗氧化性

Abstracts：One-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the conditions for ultrasonicassisted ethanol extraction of total flavonoids from the dried shoot ofEquisetum ramosissimumDesf. grown in west Hunan province, China. The extraction yield of total flavonoids was 1.16% under the optimal extraction conditions:45% ethanol aqueous solution as the extraction solvent, material-to-liquid ratio 1:30 (g/mL), ultrasonic treatment time 30 min, and extraction temperature 60 ℃. The total flavonoids could scavenge hydroxyl free radicals in a concentration-dependent fashion and had stronger inhibitory effect against lipid peroxidation in tea seed oil than in lard.

Key words：Equisetum ramosissimumDesf.；total flavonoids；extraction；fat and oil；antioxidation

節(jié)節(jié)草又稱銼草、筆頭草、筆筒草、節(jié)骨草，是木賊科植物Equisetum hiemaleL. 之木賊亞屬的干燥地上部分，在《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》中學(xué)名叫木賊[1]，在湘西地區(qū)分布廣泛，藥用歷史悠久，有散風(fēng)熱、退目翳之功效，用于治療風(fēng)熱目赤、迎風(fēng)流淚、目生云翳、肝炎、咳嗽、支氣管炎、泌尿系統(tǒng)感染等。全草含有機(jī)酸類、黃酮類、生物堿及有機(jī)硅酸鹽等化學(xué)成分[2]。

黃酮類化合物具有多種生物活性，能降壓、鎮(zhèn)痛、抗菌、清熱解毒、抑制脂肪氧化酶、抗癌等[3-4]，對(duì)治療冠心病、延緩動(dòng)脈粥樣硬化和消除自由基等方面有顯著效果。

食用油脂氧化變質(zhì)會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，部分酸敗產(chǎn)物還具有致癌作用。食品工業(yè)中常添加抗氧化劑以預(yù)防或抑制油脂和含油食品氧化變質(zhì)，目前常用的抗氧化劑均為人工合成，但研究發(fā)現(xiàn)均對(duì)人體有一定毒副作用[5-6]，過量時(shí)存在致癌可能性[7]，因此，安全、保健的天然食品抗氧化劑取代人工合成抗氧化劑是食品添加劑的發(fā)展趨勢(shì)。天然產(chǎn)物中黃酮類化合物在食品抗氧化劑方面的顯著效果，使其成為廣大科研工作者的關(guān)注熱點(diǎn)。

目前節(jié)節(jié)草的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理研究等方面[8-9]，但對(duì)節(jié)節(jié)草中黃酮類化合物的提取工藝以及作為油脂抗氧化劑的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以湘西特色植物節(jié)節(jié)草為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究總黃酮的超聲波輔助提取工藝及其對(duì)油脂抗氧化能力的影響，旨在為進(jìn)一步利用節(jié)節(jié)草資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節(jié)節(jié)草采于吉首本地，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、健康無(wú)病蟲害的植株，干燥后取地上部分剪成碎末并裝進(jìn)樣品袋，存放于干燥箱中備用；新鮮豬板油 市售；茶籽油 吉首本地。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、沒食子酸、VC、碘化鉀、冰醋酸、三氯甲烷、淀粉、碘等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ250-E型超聲波清洗器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、K-201B-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；723可見分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋；FA2104N型電分析天平 上海思龍科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的定量測(cè)定

1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取120℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁對(duì)照品23.0mg，置于100mL容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，備用。精密吸取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL容量瓶中，再分別加水6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0mL。加入5% NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL，搖勻，放置6min；再加入4% NaOH溶液10.0mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度(C)對(duì)吸光度(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：C=0.0939A，R2=0.9998，蘆丁質(zhì)量濃度在0～0.05mg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

1.3.1.2 總黃酮提取方法及定量測(cè)定

稱取1.00g節(jié)節(jié)草粉末于具塞錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，置于超聲波清洗器中超聲一定時(shí)間，過濾，濾液經(jīng)石油醚萃取脫色后，定容至50mL，精密移取2.0mL于25mL容量瓶中，采用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，以空白管為參比于510nm處測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總黃酮含量與總黃酮得率[10]。

通過改變?nèi)軇╊愋?、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲處理時(shí)間及超聲溫度等因素探討超聲波輔助乙醇提取技術(shù)對(duì)節(jié)節(jié)草總黃酮提取效果的影響。

1.3.2 總黃酮的定性分析

將節(jié)節(jié)草總黃酮提取液分別進(jìn)行三氯化鐵、氫氧化鈉水溶液、三氯化鋁、硼酸顯色反應(yīng)，對(duì)提取物進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 總黃酮抗氧化性分析

1.3.3.1 提取液清除羥自由基(·OH)實(shí)驗(yàn)

參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型[11]。分別取2mmol/L FeSO4溶液3mL，加1mmol/L H2O2溶液3mL搖勻后，加6mmol/L水楊酸溶液3mL，立即搖勻，于37℃水浴中加熱15min后取出，測(cè)其吸光度A0，然后分別加入一定質(zhì)量濃度的總黃酮提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，最后加入蒸餾水補(bǔ)充體積至10mL。繼續(xù)水浴加熱15min，在波長(zhǎng)510nm處以空白液為參比測(cè)其吸光度Ax。采用以上方法實(shí)驗(yàn)，取1.0mL蒸餾水代替總黃酮提取液，37℃恒溫15min后測(cè)其吸光度A0。均重復(fù)3次。

式中：P為羥自由基的清除率；A0為空白液的吸光度；Ax為加入黃酮后溶液的吸光度；A00為加入蒸餾水后的溶液吸光度。

1.3.3.2 提取液脂質(zhì)自氧化實(shí)驗(yàn)

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按照文獻(xiàn)[12]方法，在25mL具塞比色管中，依次加2.00mL氯仿-冰醋酸、1.00mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的淀粉溶液，分別取已標(biāo)定過的KI-I2標(biāo)準(zhǔn)溶液(含碘0.00～0.83μmol)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，加水定容至25mL，搖勻，取上層清液，以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)585nm處測(cè)定吸光度，碘量(M，μmol) 在0～0.96μmol間與吸光度(A)存在良好的線性關(guān)系，回歸方程為M＝4.0153A＋0.0039，R2＝0.9986。

2)油脂過氧化值(pexoxide value，POV)的測(cè)定：采用國(guó)際通用的烘箱儲(chǔ)藏法[13]使之發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)并進(jìn)行測(cè)定。稱取20g油脂及2mL提取物，攪拌均勻后，放入烘箱中強(qiáng)化保存，間隔1h交換它們?cè)诤嫦渲械奈恢貌⑷〈郎y(cè)樣品1mL，加入2.00mL 氯仿-冰醋酸溶解，再加入1.00mL 10% KI溶液，加蓋搖勻30s，并置于暗處反應(yīng)3min。取出后立即用水稀釋并加入1.00mL 1%淀粉溶液，以后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出碘生成量，按下式計(jì)算油脂過氧化值(POV)及總黃酮對(duì)油脂的保護(hù)率：

式中：W表示油脂質(zhì)量/kg。

式中：η為總黃酮對(duì)油脂的保護(hù)率/%；POV初為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)化氧化時(shí)的過氧化值/(mmol/kg)；POV末1為添加總黃酮的油脂強(qiáng)化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)；POV末2為未添加總黃酮的油脂強(qiáng)化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮的定性檢測(cè)

節(jié)節(jié)草地上部分總黃酮提取液的顏色反應(yīng)結(jié)果見表1，可知其中主要含黃酮類和黃酮醇類物質(zhì)。

表1 總黃酮提取液顯色結(jié)果Table 1 Coloration results of total flavonoid extract from the dried shoot of Equisetum ramosissimum Desf.

2.2 超聲提取工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)提取效果的影響

本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑，其料液比將影響總黃酮的得率。稱取節(jié)節(jié)草粉末1.00g，按1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的料液比，分別加入45%的乙醇，在60℃條件下超聲提取30min，測(cè)定濾液的吸光度，考察不同料液比對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on total flavonoid extraction yield

由圖1可知，在1:10～1:25范圍內(nèi)，隨提取溶劑用量增大總黃酮提取率逐漸上升，當(dāng)達(dá)到1:25后，總黃酮得率增加緩慢。通常情況下，增加溶劑的量可以降低樣品周圍的濃度，使細(xì)胞壁內(nèi)外的濃度差增大，有利于有效成分的溶出。當(dāng)料液比超過1:25后，總黃酮得率增加緩慢，趨于穩(wěn)定，這是由于傳質(zhì)效率已趨于最大。從浸提效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)選1:25的料液比進(jìn)行提取。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

以1:25的料液比，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大，這是由于黃酮的極性較小，易溶于中等或中等偏下極性溶劑。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由45%增大到55%時(shí)，黃酮得率反而下降，可能由于乙醇分子間以及與水分子間存在氫鍵，從而使水的極性降低，導(dǎo)致黃酮的溶解度下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過75%后，黃酮得率再次降低，這可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，溶液極性相對(duì)偏高，從而導(dǎo)致黃酮類化合物溶解度減小。根據(jù)“相似相溶原理”，黃酮類化合物的溶出度與溶劑的極性有關(guān)，極性相近可達(dá)到最大溶出度，綜合考慮，選用45%乙醇溶液作為提取溶劑。

2.2.3 超聲處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響

稱取節(jié)節(jié)草粉末1.00g，按1:25的料液比，加入45%的乙醇，在60℃條件超聲處理不同時(shí)間，過濾后測(cè)定濾液的吸光度，計(jì)算黃酮得率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮得率隨超聲波處理時(shí)間呈先增大后減小趨勢(shì)?？赡苡捎邳S酮類物質(zhì)本身易被氧化破壞，過長(zhǎng)時(shí)間暴露在外，尤其是高溫提取時(shí)，最終總

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of sonication time on total flavonoid extraction yield

黃酮得率將減小，此外，考慮降低能耗及成本節(jié)約、提取效率以及提取周期等因素的影響，最終選取為30min為最佳提取時(shí)間。

2.2.4 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total flavonoid extraction yield

以45%乙醇為提取劑，考察了不同超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響，由圖3可知，總黃酮的得率隨超聲溫度的升高而不斷增大。原因可能是隨溫度升高，分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，有效成分滲透和溶解速度加快，從而使黃酮溶出度加大。當(dāng)溫度超過60℃后總黃酮得率無(wú)明顯提高，考慮溫度過高可能造成黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)變化、雜質(zhì)溶出量增加、后續(xù)操作不便以及溶劑損失等不利因素，最終選擇超聲溫度60℃為最佳提取溫度。

2.3 正交試驗(yàn)確定最佳條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9(34)正交表，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波處理溫度、超聲時(shí)間為考察因素，因素水平如表2所示，結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and their levels in orthogonal array design

表3 節(jié)節(jié)草總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and corresponding experimental results

以總黃酮得率為指標(biāo)，由表3中極差分析結(jié)果可知，超聲波技術(shù)提取各因素對(duì)節(jié)節(jié)草中總黃酮的提取率影響的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C＞D，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間，其中料液比的影響最大。由此得出超聲輔助法提取湘西節(jié)節(jié)草中總黃酮的最佳工藝方案為A3B2C2D2，即料液比1:30、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、超聲溫度60℃、時(shí)間30min。

2.4 最佳工藝條件驗(yàn)證

采用正交試驗(yàn)中的最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：稱取節(jié)節(jié)草粉末1.00g，分別加入30mL 45%乙醇，超聲波協(xié)同處理30min，過濾，取上清液測(cè)定總黃酮質(zhì)量及得率，平行提取3次，得率分別為1.163%、1.164%、1.161%。

2.5 節(jié)節(jié)草總黃酮抗氧化性研究

2.5.1 提取液清除羥自由基(·OH)實(shí)驗(yàn)

自由基具有很高的反應(yīng)活性，可導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷、誘發(fā)各種疾病、加速機(jī)體衰老。實(shí)驗(yàn)以沒食子酸和VC做對(duì)比，考察37℃總黃酮對(duì)自由基的清除率。由圖4可知，節(jié)節(jié)草總黃酮在10～60μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)·OH清除作用非常明顯，隨著總黃酮溶液質(zhì)量濃度增高，對(duì)·OH的清除能力也相應(yīng)增強(qiáng)。相同質(zhì)量濃度下，清除·OH的能力大小為沒食子酸＞節(jié)節(jié)草總黃酮＞VC。

圖4 VC、節(jié)節(jié)草黃酮、沒食子酸對(duì)·OH清除能力比較Fig.4 Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacities among total flavonoids from the dried shoot of Equisetum ramosissimum Desf., VC and gallic acid

2.5.2 總黃酮對(duì)油脂的抗氧化性

食用油脂含有不飽和脂肪酸，光、熱、氧氣等因素可引發(fā)脂肪酸脫去氫原子形成游離基，從而與氧結(jié)合，形成過氧化游離基，引發(fā)油脂自氧化反應(yīng)?？傸S酮作為抗氧化劑可捕獲自由基，有效抑制油脂的自氧化反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)考察了30℃節(jié)節(jié)草中總黃酮做為抗氧化劑對(duì)茶籽油和豬油的抗氧化作用。表4結(jié)果表明，添加總黃酮后，茶籽油和豬油的過氧化值均比未添加總黃酮之前降低，這表明總黃酮能增加油脂的抗氧化能力。相同條件下，總黃酮對(duì)茶籽油的抗氧化性強(qiáng)于對(duì)豬油的抗氧化性，在相同時(shí)間內(nèi)，兩者的過氧化值相差值不大。

表4 總黃酮對(duì)油脂的抗氧化性(過氧化值P O V)比較Table 4 Inhibitory effect of total flavonoids from the dried shoot ofEquisetum ramosissimum Desf. against lipid peroxidation in tea seed oil and lard

2.5.2.1 溫度對(duì)總黃酮抗茶籽油氧化效果的影響

油脂過氧化值測(cè)定過程中，溫度的高低對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響很大。由圖5可看出，在30、40℃條件總黃酮對(duì)茶籽油樣的保護(hù)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，溫度升至50℃，總黃酮對(duì)油樣的保護(hù)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)反而下降。這可能由于總黃酮熱穩(wěn)定性的降低，導(dǎo)致其對(duì)植物油樣品的保護(hù)率降低。

圖5 總黃酮對(duì)茶籽油的保護(hù)率隨溫度變化的影響Fig.5 Effect of temperature on anti-lipid peroxidation activity of total flavonoids from the dried shoot of Equisetum ramosissimum Desf.in tea seed oil

2.5.2.2 溫度對(duì)總黃酮抗豬油氧化效果的影響

圖6 總黃酮對(duì)豬油的保護(hù)率隨溫度變化的影響Fig.6 Effect of temperature on anti-lipid peroxidation activity of total flavonoids from the dried shoot of Equisetum ramosissimum Desf.in lard

如圖6所示，節(jié)節(jié)草總黃酮在30℃和40℃對(duì)豬油脂的保護(hù)情況與相同條件下對(duì)茶籽油的保護(hù)效果相似。但比較兩圖可明顯看出：在后期反應(yīng)中，節(jié)節(jié)草總黃酮對(duì)茶籽油的保護(hù)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)上升明顯，而其對(duì)豬油的保護(hù)效果則無(wú)明顯變化。據(jù)此可得出：在相同條件下，節(jié)節(jié)草總黃酮對(duì)茶籽油的保護(hù)效果大于對(duì)豬油的保護(hù)效果。

3 結(jié) 論

節(jié)節(jié)草總黃酮最佳提取工藝流程及提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、料液比(g/mL)1:30、超聲提取時(shí)間30min、超聲溫度60℃。此條件下，總黃酮得率為1.16%。將該提取物進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明節(jié)節(jié)草總黃酮對(duì)羥自由基有一定的清除能力。抗油脂氧化實(shí)驗(yàn)表明，節(jié)節(jié)草總黃酮對(duì)茶籽油的抗氧化性效果較豬油好，但受溫度、時(shí)間的影響變化較大。

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Ultrasonic-assisted Ethanol Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromEquisetum ramosissimumDesf. Grown in West Hunan

ZHANG Jun-sheng，CHEN Li-hua*，ZHANG Wen-long
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

O623.54

A

1002-6630(2011)16-0071-05

2010-12-03

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(10C26214302421；11C26414305373)；吉首大學(xué)校級(jí)科研計(jì)劃項(xiàng)目(11JDY051)

張俊生(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣庾V分析。E-mail：zhangjunshenggirl@163.com

*通信作者：陳莉華(1961—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取及應(yīng)用。E-mail：chenlihua99@163.com