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        基于酶固定的新型抗壞血酸傳感器的研究

        2011-10-19 10:30:58劉文娟劉巧玲王海霞雙少敏
        化學(xué)傳感器 2011年4期
        關(guān)鍵詞:殼聚糖檢測(cè)

        劉文娟,崔 淼,劉巧玲,王海霞,樊 麗,雙少敏,董 川

        (山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心,山西太原030006)

        0 引言

        L-抗壞血酸(如圖1所示)是一種人體必需的維生素,也是一種抗氧化劑,可提高人體的免疫力及反應(yīng)能力。有研究表明,人體內(nèi)缺乏L-抗壞血酸會(huì)導(dǎo)致黃褐斑、牙齦腫脹、粘膜出血等[1]。但是其在人體內(nèi)無法自身合成,所以從食物和藥物中攝取就成為獲取L-抗壞血酸的重要途徑。簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)抗壞血酸進(jìn)行檢測(cè)具有十分重要的意義。傳統(tǒng)抗壞血酸的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)法[2]、分光光度法[3]及色譜法[4]等。而這些方法選擇性較差、操作復(fù)雜、干擾嚴(yán)重。

        以固定化酶為特征的傳感器具有反應(yīng)快、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),是目前研究較多的生物傳感器之一。

        圖1 抗壞血酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of L-ascorbic acid

        在組裝酶生物傳感器的過程中,酶的固定和穩(wěn)定性是很重要的。許多不同的固體材料可以作為固定化酶的載體,通常,固定化方法主要有物理包埋法、吸附法、化學(xué)交聯(lián)法、共價(jià)鍵合法等。由于雞蛋膜使用簡(jiǎn)單、透氣性好、及生物兼容性好是酶的優(yōu)良載體,已應(yīng)用于酶的固定化。Wu等[5],將葡萄糖氧化酶固定于雞蛋膜檢測(cè)葡萄糖,靈敏度、穩(wěn)定性等得到了滿意的結(jié)果。Matsumoto等[6]將抗壞血酸氧化酶固定于膠原膜,研制了抗壞血酸生物傳感器,檢測(cè)范圍寬,靈敏度高。但是由于固定的酶容易脫落,所以這種抗壞血酸傳感器的使用壽命較短,重現(xiàn)性較差。

        該文采用物理包埋和化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合的固定化酶的方法,選取殼聚糖作包埋劑,戊二醛為交聯(lián)劑,將抗壞血酸氧化酶固定在雞蛋膜表面。L-抗壞血酸在抗壞血酸氧化酶(A.O)作用下經(jīng)氧氣氧化生成脫氫抗壞血酸和水。通過氧電極檢測(cè)反應(yīng)中消耗氧氣的量來測(cè)定抗壞血酸含量。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        Pasco Cl-6542氧電極 (Roseville,CA,USA),Science Workshop 500 interface數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Pasco Scientific,Roseville,CA,USA),JB-2型恒溫磁力攪拌器及PHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

        抗壞血酸氧化酶 (Sigma,活力為1620 U/mg protein),L-抗壞血酸 (北京化工廠), 殼聚糖(Sigma,脫乙酰度為 75%~85%),戊二醛(天津瑞金特化學(xué)品有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%),Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.1 mol/L)。所有化學(xué)試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

        1.2 酶電極的制備

        準(zhǔn)確稱取一定量的殼聚糖于燒杯中,加入10 mL 0.05 mol/L HCl溶液,加熱(80~90 ℃)溶解。然后將溶液冷卻至室溫,滴加0.1 mol/L NaOH溶液至pH=5.0,用直徑為35 mm的濾紙過濾得質(zhì)量濃度為0.3%的殼聚糖澄清溶液。稱取2 mg抗壞血酸氧化酶溶于28 μL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液,將制得的酶溶液在4℃下保存。

        取一個(gè)新鮮的雞蛋殼,小心地剝離蛋膜,用去離子水清洗干凈后將雞蛋膜裁成直徑1.5 cm左右的圓片,依次在膜上滴加5 μL酶溶液和100 μL殼聚糖溶液,數(shù)分鐘后滴加2 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的戊二醛,用玻璃棒輕輕地將溶液在雞蛋膜表面攪勻。室溫下放置8 h晾干,置于冰箱中冷藏過夜。 用磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=5.0)沖洗數(shù)次,洗掉未固定的酶,將酶膜緊貼在氧電極的表面,用“O”形圈固定即制得抗壞血酸酶電極。

        1.3 測(cè)定方法

        將制備好的抗壞血酸酶電極浸入5 mL 0.1 mol/L被空氣飽和的磷酸鹽緩沖溶液(pH=5.0)中,在攪拌條件下加入一定量0.1 mol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液。電極電位變化被輸入計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中,并以溶解氧濃度變化的形式輸出。記錄溶解氧濃度的下降曲線,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定抗壞血酸的含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 抗壞血酸傳感器的響應(yīng)行為

        抗壞血酸氧化酶可選擇性地將抗壞血酸催化氧化成脫氫抗壞血酸,伴隨著溶液中氧氣的消耗,如反應(yīng)式(1)所示,氧電極作為換能器檢測(cè)氧氣的消耗量,根據(jù)溶解氧濃度的降低作為傳感器的分析檢測(cè)信號(hào)??箟难釢舛鹊倪B續(xù)改變可以在傳感器上產(chǎn)生典型的響應(yīng)曲線,如圖2所示,獲得了抗壞血酸濃度和溶解氧濃度下降值之間的線性關(guān)系,校準(zhǔn)曲線如圖2內(nèi)插圖所示。

        2.2 戊二醛作交聯(lián)劑與未使用戊二醛制得酶膜的響應(yīng)信號(hào)比較

        圖2 抗壞血酸生傳感器對(duì)不同濃度的抗壞血酸溶液的響應(yīng)曲線加入 0.10 mol/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為(0)0.0、 (1)1.0、 (2)3.0、 (3)5.0、 (4)7.0、 (5)10.0、 (6)15.0 μLFig.2 Typical response curve of the ascorbic acid biosensor at pH5.0 phosphate buffer(100 mmol/L)after each successive addition of various volume of 0.10 mol/L ascorbic acid standard

        取兩個(gè)雞蛋膜,膜a以殼聚糖做包埋劑、戊二醛為交聯(lián)劑固定酶,膜b只采用殼聚糖作連接劑固定等量的酶,分別覆蓋于氧電極表面,制備抗壞血酸傳感器。在相同實(shí)驗(yàn)條件下記錄溶解氧濃度下降曲線。從圖3中可看出,相同條件下采用膜a制得的傳感器測(cè)得的溶解氧濃度下降值更大,說明戊二醛作為交聯(lián)劑,能夠減少酶的脫落,減少測(cè)定誤差。

        圖3 戊二醛作交聯(lián)劑與未使用戊二醛制得酶膜的響應(yīng)信號(hào)比較Fig.3 Comparison of the performance of two kinds of biosensors with ascorbate oxidase immobilized eggshell with or without glutaraldehyde as cross-linking agent

        2.3 溫度的影響

        移取5 mL磷酸緩沖溶液置于溫度依次為10、20、30、40、50 ℃的恒溫水浴中,分別加入等量抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄溶解氧濃度下降曲線。結(jié)果表明,隨著溫度升高,溶解氧濃度的下降值增大。說明酶在較高溫度下,能夠獲得較大反應(yīng)活性,使酶促反應(yīng)過程中氧消耗的速率加快,溶解氧濃度的改變信號(hào)較大。盡管溫度升高有利于加快酶促反應(yīng)速率,但考慮到長(zhǎng)期處于高溫環(huán)境容易使酶失活而減少使用壽命。因此,實(shí)驗(yàn)以室溫作為適宜的溫度。

        2.4 溶液pH的影響

        在pH為4.0~8.0的磷酸緩沖溶液中,分別加入 25 μL 0.10 mol/L L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄溶解氧濃度下降曲線,結(jié)果顯示,最佳pH為5.0;在 pH 為 4.0~8.0 之間,該傳感器仍可以保持其最佳響應(yīng)值的90%以上。當(dāng)pH值大于7時(shí),響應(yīng)值明顯降低。這可能是由于抗壞血酸的Pka1值為4.17,pH值過高使其脫氫生成較穩(wěn)定的烯醇式結(jié)構(gòu),而相鄰的雙鍵使得這種結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,同時(shí)脫氫抗壞血酸迅速轉(zhuǎn)變成兩種可能的二酮結(jié)構(gòu)。因此實(shí)驗(yàn)中采用pH為5.0的緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        2.5 戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

        以戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 2.5%,5.0%,10%,15%,17.5%和20%制作五種類型酶膜,覆蓋于氧電極表面制成不同抗壞血酸傳感器,在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定溶解氧濃度的下降值。結(jié)果表明,當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.5%~15%范圍內(nèi),電極響應(yīng)隨著戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大;當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15%時(shí),電極響應(yīng)隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而明顯減小。可能的原因[5,7]是戊二醛含有細(xì)胞毒素,有一定生物毒性,高質(zhì)量分?jǐn)?shù)戊二醛可能使酶部分失活,而導(dǎo)致傳感器靈敏度下降。因此實(shí)驗(yàn)中采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的戊二醛為交聯(lián)劑。

        2.6 酶固定量的影響

        在五個(gè)干凈的雞蛋殼膜上,分別滴加含酶量為 2,3,4,5,6,7 Units的酶溶液,制備一系列酶膜,并與溶解氧電極偶聯(lián)制得抗壞血酸生物傳感器。 在 5 mL 磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=5.0)中加入一定量的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄溶解氧濃度下降值(結(jié)果見表1)。從表1可看出:酶固定量在2~6 Units,溶解氧濃度的下降值隨酶量的增加而急劇增大,而當(dāng)酶固定量大于6 Units時(shí)增加幅度減小,可能是由于作為交聯(lián)劑的戊二醛用量限制了酶的最大固定量的緣故。所以實(shí)驗(yàn)采用每張膜固定6 Units抗壞血酸氧化酶為最佳酶用量。

        表1 酶固定量對(duì)傳感器響應(yīng)性能的影響Tab.1 Interference effect of ascorbic acid biosensor

        2.7 傳感器分析性能的測(cè)定

        在 5 mL 磷酸緩沖溶液 (0.10 mol/L pH=5.0)中測(cè)定0.50 mmol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄從加樣到溶解氧濃度達(dá)到基本平衡時(shí)的值,平均響應(yīng)時(shí)間約為80 s。

        該傳感器的線性回歸方程為y=4.608 23 x+0.091 17(r2=0.999 0),抗壞血酸濃度在 0.02~0.82 mmol/L之間呈良好的線性關(guān)系(如圖2所示)。以3倍信噪比值計(jì)算傳感器的檢測(cè)限為12 μmol/L。對(duì)0.50 mmol/L的抗壞血酸溶液重復(fù)測(cè)定20次,RSD=3.32%。

        以0.5 mmol/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液每隔2~3 d測(cè)定傳感器的響應(yīng)情況。將修飾的膜浸泡于磷酸緩沖溶液中置于4℃的冰箱中,待用。約90 d后,取出膜,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)值降低為初始值的87.6%,表明該傳感器具有良好的使用壽命。

        2.8 干擾實(shí)驗(yàn)

        該實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)是否產(chǎn)生干擾進(jìn)行了考察,并換算成產(chǎn)生相同的響應(yīng)信號(hào)時(shí)L-抗壞血酸的含量(表2)。對(duì)于含有Vc的實(shí)際樣品,可能存在的干擾物有D-葡萄糖、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、D-果糖、淀粉、山梨酸鉀及CaCl2。結(jié)果表明,實(shí)際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)抗壞血酸含量的測(cè)定幾乎不產(chǎn)生干擾。

        表2 干擾物質(zhì)的影響Tab.2 Effect of potential interferents on the ascorbic acid biosensor

        2.9 實(shí)際樣品的檢測(cè)

        采用該文提出的方法對(duì)市售的2種維生素C片中的抗壞血酸含量進(jìn)行檢測(cè),將結(jié)果與碘量法所得結(jié)果作了比較,并進(jìn)行了回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(見表3)表明,此生物傳感器法較傳統(tǒng)碘量法更加簡(jiǎn)便、快速,可以對(duì)維生素C補(bǔ)充劑中的抗壞血酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)。

        表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of determination of ascorbic acid in real samples

        3 結(jié)論

        該方法研制的抗壞血酸生物傳感器具有檢測(cè)范圍更寬、響應(yīng)時(shí)間更短、靈敏度更高,為食品中抗壞血酸的檢測(cè)提供了一種快捷、簡(jiǎn)便、可靠的新方法。

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