代敏，彭成，萬峰，陳丹丹

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室，成都610075；2.成都醫(yī)學(xué)院，成都610083）

5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌體外抗菌活性的比較

代敏1,2，彭成1，萬峰1，陳丹丹1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室，成都610075；2.成都醫(yī)學(xué)院，成都610083）

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子等5味收澀藥對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，統(tǒng)計分析了它們對葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和單胞菌等共11個種屬的MIC50和MIC90，并采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析法比較分析了5味收澀藥分別對葡萄球菌、魯氏不動桿菌和芽孢桿菌等11個種屬菌株抑菌活性的強弱。結(jié)果表明，5味收澀藥對受試菌均有較強的抗菌活性，總體以訶子的抗菌活性最強，其次為烏梅和石榴皮，再次為五味子，活性最差為山茱萸；且5味收澀藥對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較對革蘭氏陰性菌的活性強。

體外抗菌活性；收澀藥；乳腺炎病原菌

0 引言

收澀藥指具有斂肺澀腸、固精縮尿、止血斂瘡等作用的藥物，其中訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸具有澀腸止瀉，斂肺止咳、殺蟲、驅(qū)蟲止痢、補益肝腎等功效[1-4]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸具有抗病原微生物、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、驅(qū)蟲、抗過敏等藥理活性[5-14]。此外，烏梅、五味子和山茱萸又常作為“藥食同源”植物，被用作功能性保健食品[15,16]。鑒于收澀藥的澀腸止瀉之功效及其抗病原微生物等藥理活性，本試驗旨在對訶子、石榴皮、烏梅、五味子和山茱萸的體外抗菌活性進行比較研究，一方面為其在感染性疾病及保健食品的運用提供科學(xué)依據(jù)，另一方面為防治奶牛乳腺炎抗菌中藥的篩選及運用奠定基礎(chǔ)，以提高乳品安全。

1 實驗材料

1.1 藥物

訶子、五味子、烏梅、石榴皮和山茱萸共5味收澀藥（同仁堂成都分店）。

1.2 菌株

①質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923（成都抗菌工業(yè)研究所）；

②受試菌株：分離于四川成都、綿陽、眉山三地不同規(guī)模化奶牛場，并經(jīng)VITEK 32全自動微生物分析系統(tǒng)和16S rDNA序列分析鑒定的15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌（見表1）。

表1 實驗菌株的種類、數(shù)量及代號

表1中，凝固酶陰性葡萄球菌包括5株耳葡萄球菌、5株腐生葡萄球菌、4株木糖葡萄球菌、3株葡萄球菌屬、2株人葡萄球菌以及表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、尼泊爾葡萄球菌各1株；4株鏈球菌包括無乳鏈球菌-（B群）、乳房鏈球菌、牛鏈球菌和緩癥鏈球菌各1株；9株芽孢桿菌包括4株蠟樣芽胞桿菌、3株矮小芽孢桿菌和2株彎曲芽孢桿菌；12株單胞菌包括6株銅綠假單胞菌、3株少動鞘氨醇單胞菌、2株熒光假單胞菌、1株豚鼠氣單菌。

1.3 培養(yǎng)基

Mueller-Hintonagar（OXOID，批號729683）。

1.4 主要儀器

多點接種儀（SAKUMA MIT-P型），VITEK DENSICHEK，LABO AUTOCLAV（MLS-3780型），CO2INCUBATOR(MOC-15A)，調(diào)溫電熱套（ZDHW 2000L）。

2 實驗方法

2.1 藥物提取

稱取藥物150.0 g，根據(jù)藥物質(zhì)地不同，分別加入10倍75%乙醇回流提取2 h，過濾，收集濾液；再用8倍75%乙醇回流提取1 h，合并兩次醇提物濾液。濾渣加入8倍蒸餾水回流提取1 h，過濾，收集濾液；再次加入6倍蒸餾水回流提取0.5 h，過濾，收集濾液，合并兩次水提濾液。將水提物和醇提物的濃縮液混合，定容至0.75～2.0 g/mL。

2.2 提取物的滅菌和保存

108℃滅菌2 min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 體外抑菌活性試驗

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定5味收澀藥對15個種屬120株奶牛乳腺炎病原菌和質(zhì)控菌株的體外抑菌活性。具體方法參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準[17]。

含藥平板制備：用無菌水對受試藥進行倍比稀釋，將各提取物分別稀釋成1︰2，1︰4，1︰8，1︰16，1︰32，1︰64，1︰128，1︰256共8個梯度。在一次性無菌培養(yǎng)皿中分別加入不同濃度梯度的稀釋藥液1 mL和14 mL滅菌的MH培養(yǎng)基，充分混勻，烘干至表面無水蒸氣。以平板內(nèi)加入1 mL生理鹽水代替藥物制備陽性對照平板。

菌液配置：用麥氏比濁儀將受試菌和質(zhì)控菌用無菌生理鹽水調(diào)至菌液為0.5麥氏濃度。

最低抑菌濃度（MIC）的測定及結(jié)果判定：采用多點接種儀將菌液加入不同質(zhì)量濃度梯度的含藥平板和陽性對照平板，并以無菌生理鹽水代替菌液作陰性對照。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察各菌株的生長情況。在陰性、陽性對照成立的條件下，以平板內(nèi)無細菌生長的藥物最小濃度為此藥對該菌株的最低抑菌質(zhì)量濃度。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對含4株以上的同種屬菌株，分別統(tǒng)計其抑制50%和90%菌株的最低抑菌濃度，即MIC50和MIC90；并用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析5味收澀藥對同種屬菌株抑菌活性的強弱。

3 結(jié)果與分析

3.1 5味收澀藥的最低抑菌濃度

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮對15個種屬120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，結(jié)果如表2所示。

表2 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌質(zhì)量濃度g/L

由表2可以看出，訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮5味收澀藥對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌和質(zhì)控菌均有較強的抗菌活性，其最低抑菌質(zhì)量濃度因藥物和菌株種屬差異而明顯不同。

3.2 5味收澀藥的MIC50和MIC90

統(tǒng)計分析了訶子等5味收澀藥對金葡菌、凝固酶陰性葡萄球菌、吉氏庫特氏菌、巨型球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、單胞菌屬、魯氏不動桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌和芽孢桿菌共11個種屬菌株的MIC50和MIC90，結(jié)果如表3所示。

比較分析訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮的MIC50和MIC90，發(fā)現(xiàn)體外抗菌活性最強的是烏梅和石榴皮，其中烏梅除對陰溝腸桿菌的MIC50為12.50mg/ml，對大腸埃希菌、單胞菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌和芽孢桿菌的MIC50為6.25 mg/mL外，對其余種屬菌株的MIC50均為3.13 mg/mL；而石榴皮除對大腸埃希菌、單胞菌、魯氏不動桿菌和陰溝腸桿菌的MIC50分別為25.00～50.00，6.25～25.00，3.13～6.25 g/L和6.25 g/L外，對其余種屬菌株的MIC50均介于1.56～3.13 g/L。其次為訶子，對革蘭氏陰性菌的MIC50和MIC90分別為5.00～10.00 g/L和2.50～20.00 g/L，而對革蘭氏陽性菌的MIC50和MIC90均介于1.25～5.00 g/L。再次為五味子，除對大腸埃希菌、單胞菌和陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90較高外（8.33～33.33 g/L），對其余種屬菌株的MIC50和MIC90均介于4.17～8.33g/L。抑菌活性相對最差的是山茱萸，除對大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90為25.00 g/L，對凝固酶陰性葡萄球菌、單胞菌和魯氏不動桿菌的MIC90分別為6.25～12.50，12.50～25.00和6.25～12.50 g/L外，對其余種屬菌株的MIC50和MIC90均為12.50 g/L。

3.3 5味收澀藥體外抗菌活性的比較分析

用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析了訶子、五味子、烏梅、山茱萸和石榴皮5種收澀藥對不同種屬菌株體外抑菌活性的強弱，結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，菌株種屬不同，5味收澀藥表現(xiàn)出的抑菌活性亦明顯不同。對于金葡菌，以石榴皮（2.46 g/L）的抗菌活性最強，與五味子、烏梅和山茱萸具有統(tǒng)計學(xué)差異；其次為訶子（3.75 g/L）和烏梅（4.30 g/L）；再次為五味子（7.74 g/L）；最差為山茱萸（11.72 g/L），其最低抑菌濃度顯著高于石榴皮、訶子和烏梅（P＜0.001）。對于凝固酶陰性葡萄球菌，以烏梅（3.53 g/L）和訶子（3.64 g/L）的體外抑菌活性最強，與五味子和山茱萸有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）；其次為五味子（7.46 g/L）和石榴皮（8.56 g/L）；抑菌活性最差為山茱萸。對于吉氏庫特氏菌、巨型球菌、鏈球菌和芽孢桿菌，總體以山茱萸的抑菌活性最差，與訶子、五味子、烏梅和石榴皮有統(tǒng)計學(xué)意義；訶子的體外抗菌活性最強，但訶子、五味子、烏梅和石榴皮之間無統(tǒng)計學(xué)差異。對于大腸埃希菌，以烏梅（8.46 g/L）和訶子（12.37 g/L）的體外抗菌活性最強；其次為五味子（21.05 g/L）和山茱萸（24.26 g/L），抑菌活性最差的為石榴皮（27.19 g/L）。對于單胞菌、魯氏不動桿菌和陰溝腸桿菌，以訶子和烏梅的抑菌活性最強；其次為石榴皮和烏梅；最差為山茱萸，與訶子、烏梅、五味子和石榴皮比較有統(tǒng)計學(xué)差異。對于產(chǎn)吲哚金黃桿菌，以石榴皮（2.82 g/L）的活性最強；其次為訶子（4.38 g/L）和烏梅（5.21 g/L）；再次為五味子（8.33 g/L）；最差為山茱萸（11.46 g/L）。

表3 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌的MIC50和MIC90g/L

表4 5味收澀藥對奶牛乳腺炎病原菌體外抑菌活性的比較分析（X±S）g/L

4 討論

本研究通過瓊脂平板二倍稀釋法測定了訶子、烏梅、石榴皮、五味子和山茱萸對15個種屬33種120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌濃度，一方面排除了試管法中藥物顏色對實驗結(jié)果判定的影響，避免了菌株種類及數(shù)量少等客觀因素對實驗結(jié)果的影響，另一方面通過MIC、MIC50和MIC90的定量分析及現(xiàn)代統(tǒng)計學(xué)方法的綜合運用，首次評價了5味收澀藥體外抗菌活的性強弱。結(jié)果表明，5味收澀藥中總體以訶子的抗菌活性最強，MIC為1.25～20.00 g/L，對大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的抑菌活性相對最差，與李仲興等[18]報道一致，其次為烏梅和石榴皮，其中烏梅的MIC為0.78～12.50 g/L，與文獻[19,20]報道略有差異；石榴皮的MIC為1.56～50.00 g/L，與文獻[21]報道出入較大，分析其原因，可能與藥物產(chǎn)地、批次、提取方法及菌株來源等的差異有關(guān)，具體原因是否如此，有待進一步分析。再次為五味子，MIC為2.08～33.33 g/L。相對活性最差為山茱萸，MIC為1.56～25.00 g/L，除對大腸埃希菌的活性略強于石榴皮外，對其它種屬受試菌的抑菌活性均弱于訶子、烏梅、石榴皮和五味子。比較分析藥物對不同種屬菌株的抑菌活性差異，發(fā)現(xiàn)5味受試藥對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較對革蘭氏陰性菌的活性強，且不同藥物對不同種屬的菌株活性差異較大，以石榴皮表現(xiàn)尤為明顯，對金葡菌和產(chǎn)吲哚金黃桿菌在5味收澀藥中活性最強，而對大腸埃希菌的活性又最弱，這也提示我們臨床選用收澀藥防治感染性疾病時，應(yīng)針對具體病情及其感染病原的種類選用相對較為敏感的抗菌中藥。此外，本研究還對收澀藥五倍子的抗菌活性進行了研究，表明其抗菌活性均強于本文中受試的5味藥；結(jié)合對清熱藥、解表藥和化濕藥等中藥體外抗菌活性的系統(tǒng)比較研究，筆者發(fā)現(xiàn)以收澀類藥物的體外抗菌活性最強，而關(guān)于收澀藥防治奶牛乳腺炎的臨床運用情況又是否如此，卻有待于后續(xù)“收澀藥體內(nèi)抗菌活性及其防治奶牛乳房炎的臨床療效”等研究的深入探討。

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Comparative study on antibacterial activity in vitro of 5 kinds of astringent therapy herbs against pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis

DAI Min1,2，PENG Cheng1，WAN Feng1，CHEN Dan-dan1
（1.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM Resources,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China）

The agar dilution assay was used to test the minimal inhibitory concentration for 5 astringent therapy herbs to 120 strains pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis.To compare antibacterial activity,one-factor analysis of variance(ANOVA),MIC50and MIC90were used for statistical analysis.The results showed that 5 astringent therapy drugs had strong antimicrobial activity against 120 clinical isolates from cows.And Terminalia chebula Rotz had strongest antibacterial effects;dark plum and pomegranate peel had higher antibacterial effects;Schisandra had high antibacterial effects;cornus officinalis had the lowest antibacterial activity.Furthermore,compared with gram-negitive germs,all drugs showed a strong antibacterial activity to gram-positive germs,and the experimental drug showed different antibacterial activity to different species of experimental bacteria.

in vitro antibacterial activity;astringent therapy herbs;pathogenic bacteria from mastitis

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0041-04

2010-10-12

國家“十一五”支撐重點項目（2009BAI84B04）。

代敏（1974—），女，副教授，主要從事抗菌中藥的藥效和毒理研究。

彭成