包秋華，陳永福，張家超，孫志宏，包艷，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

一種快速定性和定量檢測(cè)發(fā)酵乳中L.fermentum的方法

包秋華，陳永福，張家超，孫志宏，包艷，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

通過比對(duì)發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）與其他乳酸菌的16S rRNA基因序列的異同，設(shè)計(jì)出L.fermentum的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物進(jìn)行種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜和實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析，建立一種快速檢測(cè)發(fā)酵乳中L.fermentum的定性和定量測(cè)定方法。

乳酸菌；發(fā)酵乳桿菌；PCR；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

目前對(duì)多菌復(fù)合的發(fā)酵乳樣本中發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)的定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法[1-5]，傳統(tǒng)生理生化方法易受選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測(cè)效率有限[1]。乳酸菌活菌數(shù)量是評(píng)價(jià)活性乳酸菌制品質(zhì)量的重要指標(biāo)[3,6-8]，平板菌落計(jì)數(shù)法是微生物學(xué)中最常見、最標(biāo)準(zhǔn)的一種活菌計(jì)數(shù)方法，但操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)乳酸菌培養(yǎng)還需要厭氧裝置[6]。與傳統(tǒng)的理化鑒定和平板定量方法相比，16S rDNA基礎(chǔ)上的PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)乳酸菌更加快速，而且特異性和敏感性更強(qiáng)[1,4-5,7,9-10]。其中Dickson曾采用種屬特異性引物成功定性分析了臨床醫(yī)學(xué)樣本的L.fermentum[1]。本文設(shè)計(jì)種屬特異性引物利用PCR和RT-PCR技術(shù)建立了一種快速定性、定量檢測(cè)發(fā)酵乳中L.fermentum的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種和樣本來(lái)源

標(biāo)準(zhǔn)菌株L.fermentum 1.1880，L.rhamnosus 1.2134，L.plantarum 1.2437，標(biāo)準(zhǔn)菌株L.acidophilus ATCC 4356，L.casei ATCC393；L.fermentum F6為本實(shí)驗(yàn)室從酸奶中分離得到具有益生特性的發(fā)酵乳桿菌[2,11]。傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸奶樣（25#和36#）為本實(shí)驗(yàn)室于2009年從西藏采的自然發(fā)酵乳樣品。

1.2 主要試劑

載體pMD-18T，Taq DNA polymerase，DNase I，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量的試劑盒（SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit，DRR063A，包括：DRR037S和DRR 041A）；Trizol試劑盒。

1.3 主要儀器

PTC-200梯度PCR儀，ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)，Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR儀，美國(guó)MP FastPrep-24快速核酸提取儀。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)

從Genbank中下載L.fermentum不同菌株及其他乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign進(jìn)行序列比對(duì)，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過GenBank中Blast檢測(cè)引物特異性，獲得L.fermentum的特異種引物。引物序列如下：上游引物L(fēng)Ff：5’-ATGGTGCTTGCACCTGATTG-3’，下游引物L(fēng)Fr：5’-ACTACCAGGGTAT CTAATC C-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為746 bp；引物由上海桑尼有限公司合成。

2.2 L.fermentum 1.1880的16S rDNA基因的克隆

采用CTAB法和凍融法[12]提取L.fermentum 1.1880的基因組DNA，DNA純化后取約100 ng DNA做PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系25.0 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，共2.5 μL 5 mmol/L上下游引物（LFf和LFr），0.3 μL 5 U/μL Taq酶，用二次蒸餾水補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性40 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次；72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后將L.fermentum 1.1880的PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T連接并轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR、酶切分析等方法檢測(cè)獲得陽(yáng)性克隆子pFT[13]。

2.3 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒pFT總DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出拷貝數(shù)，做10倍系列稀釋，梯度稀釋至109～102拷貝數(shù)/μL的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

2.4 樣本的RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按Trizol試劑盒（Invitrogen）說(shuō)明書提取樣品RNA，然后用DNase I處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增按大連寶生物工程有限公司（TaKaRa Code:DRR037S）說(shuō)明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)15 min；85℃變性5 s，在溫度-20℃下保存。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評(píng)定

以待測(cè)樣品cDNA和外標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用L.fermentum種特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃變性25 s，95℃變性25 s，60℃退火22 s，40個(gè)循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件實(shí)現(xiàn)發(fā)酵乳中L.fermentum的快速定量檢測(cè)。

繪制融解曲線的范圍從70℃緩慢升溫至95℃，溫度每升高0.5℃讀一次熒光值，由IQ5 Real-Time PCR儀自動(dòng)繪制融解曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 快速定性檢測(cè)L.fermentum

取L.fermentum和其他乳桿菌采用PCR方法檢測(cè)引物的特異性并定性檢測(cè)發(fā)酵乳中的L.fermentum，樣本經(jīng)L.fermentum的種屬特異性引物擴(kuò)增，在746 bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶時(shí)，表明含有L.fermentum，若在預(yù)期的位置沒有檢測(cè)到特征條帶，則表明此樣品中不含L.fermentum，其中部分結(jié)果如圖1所示。圖1中，7～10為L(zhǎng).fermentum外的其他種乳酸菌，結(jié)果為陰性，說(shuō)明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。泳道5～6為從西藏采的自然發(fā)酵乳樣本，沒有預(yù)期特征條帶出現(xiàn)，說(shuō)明這2個(gè)樣本中沒有L.fermentum。

圖1 發(fā)酵乳桿菌的引物特異性驗(yàn)證及樣本的定性檢測(cè)

圖1中，M為DL2000 Marker；1為pFT作為陽(yáng)性對(duì)照；2為dH2O作陰性對(duì)照；3為L(zhǎng).fermentum 1.1880；4為L(zhǎng).fermentum F6；5為酸奶樣25#（從西藏采的傳統(tǒng)發(fā)酵乳）；6為酸奶樣36#（從西藏采的自然發(fā)酵乳）；7為L(zhǎng).casei ATCC393；8為L(zhǎng).rhamnosus 1.2134；9為L(zhǎng).acidophilus ATCC 4356；10為L(zhǎng).plantarum 1.2437。

3.2 L.fermentum的快速定量檢測(cè)方法的建立

以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板pFT的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)得到L.fermentum的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2可見，Ct值和拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.392X+39(Y為Ct值，X為初始模板量的對(duì)數(shù))，初始濃度與Ct值之間線性相關(guān)系數(shù)R2為0.991，斜率為－3.392。R2＞0.9表明所建立的L.fermentum標(biāo)準(zhǔn)曲線符合Real-Time PCR定量的要求。取L.fermentum F6的發(fā)酵豆乳15 h的乳樣進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算后為7.3±0.4 g-1。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)發(fā)酵乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)L.fermentum種特異性引物，采用PCR和Real-Time PCR絕對(duì)定量技術(shù)成功建立了發(fā)酵乳中L.fermentum的快速定性和定量檢測(cè)方法，此技術(shù)具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，并已經(jīng)申請(qǐng)專利。定性分析的關(guān)鍵是特異性引物的設(shè)計(jì)和PCR條件的摸索；絕對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量分析的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)品的制備，本文選擇含有熒光定量PCR擴(kuò)增片段克隆到質(zhì)粒中回收質(zhì)粒，構(gòu)建了含有目的條帶的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可靠易行。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，若利用絕對(duì)定量分析樣本中活菌的數(shù)量當(dāng)提取RNA時(shí)最好采用核酸提取儀破碎原始樣本中的細(xì)胞，比液氮研磨法獲得RNA多，不易降解，大大提高準(zhǔn)確率。

[1] DICKSON E M,RIGGIO M P,MACPHERSON L M.A Novel Species-Specific PCR Assay for Identifying Lactobacillus Fermentum[J].Journal of Medical Microbiology,2005,54:299-303.[BQH12]

[2] 張延超.具有益生特性發(fā)酵乳桿菌的篩選及其在豆乳中的發(fā)酵特性研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] 方改霞,單林娜,李慧,等.多菌種酸奶中活性乳酸菌的計(jì)數(shù)方法研究[J].微生物學(xué)雜志,2009,29(5):101-104.

[4] 趙文靜,劉文俊,李妍,等.乳酸菌定量分析方法研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(2):121-124.

[5] 趙文靜,李妍,高鵬飛,等.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在乳酸菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(4):433-437.

[6] 呂嘉櫪,張淑娟,陳銳,等.酸乳中乳酸菌計(jì)數(shù)方法的研究[J].西北輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào).2001,19:26-28.

[7] 楊美芬,王玉明,黃永坤,等.用細(xì)菌16S rRNA熒光定量PCR法檢測(cè)腸道菌群的變化[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(4):266-269.

[8] 朱寶玉,張秀麗,廖興廣,等.活性乳酸菌制品中乳酸菌計(jì)數(shù)條件的優(yōu)化研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,14(5):561-563.

[9] FRIEDRICH U,LENKE J.Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence in Situ Hybridization[J].Appl Environ Microbiol,2006,6:4163-4171.

[10] GRATTEPANCHE F,LACROIX C,AUDET P,et al.Quantification by Real-Time PCR of Lactococcus lactis Subsp.Cremoris in Milk Fermented by a Mixed Culture[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,66:414-421.

[11] 王水泉,包艷,張延超,等.具有潛在益生特性的發(fā)酵乳桿菌在豆乳中的發(fā)酵特性[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010:38(5):7-11.

[12] 于潔,孫志宏,張家超,等.16S rDNA-RFLP技術(shù)鑒定西藏地區(qū)乳制品中的乳桿菌[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(6):804-810.

[13] 薩姆布魯克J,拉塞爾DW,著.黃培堂主譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）[M].北京:科學(xué)出版社,2002:68-105.

A rapid qualitative and quantitative detection method of L.fermentum in the fermented milk

BAO Qiu-hua,CHEN Yong-fu,ZHANG Jia-chao,SUN Zhi-hong,BAO Yan,ZHANG He-ping
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education ministry Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot Inner Mongolia 010018,China)

The differences in 16S rRNA gene region between L.fermentum and other Lactic acid bacteria were compared.The species specificity primer of L.fermentum was designed and used to carry out species-specific PCR assay and fluorescent quantitative real-time PCR.Through analyzing the electrophoretic pattern and the curve of RT-PCR,a rapid qualitative and quantitative method for the detection of L.fermentum in the fermented milk was established.

Lactic acid bacteria;L.fermentum;Species-specific PCR;Real-Time PCR

TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0059-03

2010-10-08

973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(2010CB134502)；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT0967)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.30760156）。

包秋華（1973-），女，助理研究員，研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩?/p>

張和平