王立娜，苑春艷，李春，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

奶山羊青春期乳腺發(fā)育重要基因RelA的全長克隆

王立娜，苑春艷，李春，李慶章，高學軍

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

從本實驗室已建立的關中奶山羊7個時期乳腺Long-SAGE標簽庫中篩選出在青春期高表達的RelA基因，用RACE方法克隆并獲得關中奶山羊RelA基因的全長，將全長序列與NCBI GenBank中人（H.sapiens）和牛（Bos taurus）數(shù)據庫進行同源性比對，證實用所選EST標簽引物克隆出的基因全長是奶山羊RelA基因。

奶山羊；乳腺；RACE；RelA

0 引言

cDNA微陣列雜交技術（cDNA mivroarray hybridization）、長標簽基因表達系列分析（Long Serial Analysis of Gene Expression，Long SAGE）等方法使具有潛在功能意義的EST（expressed sequence tag，EST）片段數(shù)量大量增加[1]，然而EST片段所對應的新基因全長序列的獲得，仍然是進行新基因功能研究的障礙[2-5]，cDNA末端快速擴增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術使未知基因的快速擴增成為可能[6,7]。

目前，人、小鼠、牛等物種的核因子κB（NF-κB）亞單位RelA（V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A(avian)，RelA）基因已經克隆出來，但是關于羊的RelA研究還沒有報道。為進一步探討RelA的功能，闡明其在乳腺中發(fā)揮的生物學作用，本研究擬通過已構建的奶山羊乳腺EST標簽庫獲得的RelA特異性標簽，采用RACE技術克隆關中奶山羊乳腺新基因RelA全長cDNA序列，為進一步研究基因RelA的功能奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

關中奶山羊青春期乳腺組織（液氮保存），SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Code No：634914），Trizol（Code No:DRR02AG），pMD18-T載體，DNA Ladder 2000 Marker，PCR儀。

1.2 引物設計

根據本實驗室已建立的關中奶山羊乳腺Long-SAGE標簽庫，選取RelA基因的EST標簽，堿基序列為CTGATGGAGTACCCTGA，其NCBI BLAST結果在牛、人的RelA基因同源性為100%。以標簽本身作為3'RACE基因特異性引物W6：5'–catgctgatggagtaccctga–3'，以3'RACE結果設計5'RACE的基因特異性引物RelA 1：5'–CCCGAGAGGAGGCCATTGGTGAG–3'。SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒提供通用引物：10×universal Primer A Mix（UPM），Long（0.4 μmol/L）：5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'，Short（2 μmol/L）：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，Nesteduniversal Primer A（NUP；10 μmol/L）5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'。

1.3 奶山羊乳腺組織總RNA的提取及cDNA的獲得

取液氮保存的奶山羊青春期乳腺組織（80 mg左右）在液氮中研磨成細粉，采用Trizol試劑提取總RNA。經甲醛變性凝膠電泳及紫外分光光度計測定OD值分析RNA的完整性及濃度，保存于液氮中備用。

按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書進行反轉錄，取2個0.2 mL的PCR管，5'RACE cDNA加入2 μL總RNA、1uL 5'–CDS primer、1uL SMARTⅡA oligo（12m/L）、1 μL滅菌水；3'RACE cDNA加入2 μL總RNA、1 μL 3'-CDS primer和2 μL滅菌水。輕輕混勻，于70℃加熱2 min，冰上冷卻2 min，離心使液體沉淀。加入2 μL 5×第一鏈緩沖液、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 ul dNTP Mix（10 nmol/L）、1μL的MMLV逆轉錄酶，輕轉混勻，離心使液體沉底，金屬浴42℃（1.5 h），加入20 μL滅菌水，于70℃加熱2 min滅活，獲得3'cDNA和5'cDNA凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 奶山羊RelA基因3'端序列和5'端序列的獲得

用通用引物混合物UPM、W6引物進行3'RACE PCR擴增，25 μL的PCR體系為：4 μL的dNTP、滅菌水、3 μL的UPM、12.5 μL的2×GC BufferⅠ、3/5 RACE引物、3'/5'LA Taq酶0.25 μL。采用降落PCR進行擴增以提高特異性，擴增參數(shù)為：94℃2 min；94℃30 s，72℃2 min，12個循環(huán)；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5個循環(huán)；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，30個循環(huán)，△T為-0.6℃；72℃，7 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收特異性片段，將回收的DNA經16℃過夜連接至pMD18-T載體，然后進行轉化，在含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選后，挑選單菌落并在含有Amp抗性的5 mL液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，菌液用M13通用引物進行PCR驗證，挑選正確條帶的菌液送北京英駿生物公司進行測序，每個測序片段分別挑選3個平行菌。

以3'RACE測序序列設計5'端引物RelA 1，PCR程序同上，膠回收特異性片段，克隆連接至pMD18-T載體。經含Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選后，挑選單菌落，菌液用M13通用引物驗證，挑選驗證正確的菌液送北京英駿生物公司進行測序，每個測序片段分別挑選3個平行菌。

1.5 奶山羊RelA基因全長的擴增與鑒定

將3'RACE和5'RACE擴增的結果用Contig Express生物學軟件拼接，初步得出全序列，按照拼接結果設計全長引物。引物序列為：

RelA上：5'-ATTGGTGAGGAGGGAGTAGGGT-3'

RelA下：5'-AGTAAAAACTGAGCCTCCTGACT G-3'

總RNA經反轉錄合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板經PCR擴增RelA基因全長。PCR體系同上，擴增參數(shù)為：94℃2 min；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5個循環(huán)，△T為-1.0℃；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個循環(huán)；72℃，7 min。將PCR產物回收連接至pMD18-T載體，轉化Top10感受態(tài)細胞，涂含Amp抗性的培養(yǎng)板經篩選后挑取單個菌落，酶切驗證后將3個平行菌液送北京英駿公司測序。

1.6 奶山羊RelA基因序列分析

使用Gene Runner，DNAMAN，CLUSTAL，PHYLIP等生物學軟件，對奶山羊RelA基因序列及對應氨基酸序列進行分析，并與其他物種的RelA序列進行比較。

2 結果與分析

2.1 總RNA的電泳結果

總RNA提取后，用甲醛變性膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA質量。電泳條帶以28S rRNA和18S rRNA為主（圖1），5S rRNA條帶模糊；OD值為1.95，在1.8～2.0之間，表明所提RNA純度較高，完整性較好，可滿足下一步試驗。

總RNA為模板，經MMLV進行反轉錄后，用GAPDH看家基因進行驗證，PCR產物經電泳后可見一條296 bp左右的條帶，陰性對照無條帶（圖2），表明反轉錄成功。

2.2 奶山羊RelA基因3'端序列和5'端序列的獲得

用試劑盒提供的引物UPM和W6進行RACE PCR反應，采用降落PCR以提高產物特異性，獲得一條特異性PCR條帶，片段大小為997 bp（圖3），其3'端有poly（A）尾巴。5'RACE擴增根據3'端序列結果設計的引物與UPM擴增，擴增得到一條735 bp的條帶，其5'RACE的3'端引物為3'RACE上的一段反向序列，與其5'端有116 bp的重疊。

圖1 總RNA提取的電泳結果

圖23 'cDNA和5''cDNA驗證電泳結果

圖3 奶山羊RalA的3'RACE和5'RACE電泳圖

2.3 奶山羊RelA基因全長的獲得

根據3'末端（997 bp）和5'末端（735 bp）測序的結果，用全長上下游引物進行全長擴增，預計長度為1.5kb，回收PCR克隆產物，連接至pMD18-T載體測序，測序結果為1499bp，與預期結果相符（圖4）。

圖4 奶山羊RELA的全長電泳圖

2.4 RelA基因核苷酸與氨基酸序列分析

根據3'末端997bp和5'末端735bp的測序結果，拼接cDNA全長為1 615bp，包括編碼區(qū)和poly（A）結構，所得poly（A）尾巴含有25A，將cDNA全長經BLAST與其它物種進行同源性比對，結果為：牛（95%）、人（90%）、小鼠（77%）（圖5）。cDNA全長的開放閱讀框由第230位堿基處開始，到第802位堿基處結束，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共可編碼18種共190個氨基酸（圖6），等電點為3.46，結構中包含有無規(guī)卷曲、β片層等二級結構，將其編碼的氨基酸序列經FLAST與其它物種進行同源性比對，結果為：牛（100%）、人（100%）、小鼠（100%）。

圖5 Mega作系統(tǒng)發(fā)生樹分析

圖6190 個氨基酸為Helical wheel圖示

3 討論

乳腺的發(fā)育情況顯著影響其隨后的泌乳功能，乳腺的充分發(fā)育是奶山羊等奶用動物高產的前提。如何調控奶山羊乳腺使之得到最充分的發(fā)育，從而具備最大泌乳潛能，是提高奶山羊等奶用動物單產的關鍵。在基因水平上對青春期乳腺發(fā)育進行研究，能夠為最大限度地調控奶山羊乳腺發(fā)育提供理論依據，進而提高乳腺的泌乳量及乳品質，具有潛在的重要經濟價值。目前，在乳腺研究中還沒有對RelA基因的報道。根據關中奶山羊乳腺Long-SAGE文庫中的數(shù)據分析[2-3]，RelA在乳腺發(fā)育的不同時期，表達豐度差異顯著，只有在青春期高表達，妊娠一個月時表達量很低，在其后的泌乳期及退化期均不表達，由此看出，RelA基因在乳腺的青春期發(fā)育中起著一定作用，但其具體作用機制還不清楚，需要進一步深入研究。

采用RACE方法克隆未知基因，其正確序列的獲得并非容易，RACE實驗的成功很大程度上取決于引物的特異性以及cDNA模板的質量。RACE要求引物的GC含量在50%～70%，退火溫度在65℃以上，以此提高引物的特異性。以EST標簽序列作為RelA的特異性引物時，要在5'端加上構建Long-SAGE文庫的標簽酶NlaⅢ的識別序列“CATG”四個堿基，但因擴增之前并不知目的基因的片段大小，所以很難判斷哪一條是目的帶，因此增加了很多工作量。cDNA模板的質量也起著關鍵因素，只有用高質量的RNA逆轉錄得到的模板進行擴增，所擴增的目的條帶才會有重復性。本實驗選擇用RelA表達豐度高的青春期乳腺組織提取RNA為模板，成功地克隆了奶山羊RelA基因的全長，為RelA基因的功能研究和進一步探討RelA基因對奶山羊乳腺發(fā)育的調控奠定了實驗基礎。

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Cloning of gene RelA in virgin mammary gland of dairy goat

WANG Li-na,YUAN Chun-yan,LI Chun,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The high expression gene RelA in virgin was screened from the Long-SAGE libraries established in this lab of 7 stages of Guanzhong dairy goat mammary gland.The full length of gene RelA sequence was cloned and obtained with RACE.Comparing the homology with H.sapiens and Bos taurus in NCBI GenBank,it was confirmed that the gene cloned with EST tag primer was exactly the gene RelA of dairy goat.

dairy goat；mammary gland；RACE；RelA

Q78,TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0031-03

2010-11-30

黑龍江省國際合作項目（WB07A06），東北農業(yè)大學創(chuàng)新團隊項目（CXT005-1-1/CXT005-1-2）。

王立娜（1985-），女，碩士，研究方向為泌乳生物學與乳腺生物功能調控。

李慶章