高建新，傅松哲，龍慧,肖菊珍

（南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌330038）

阪崎腸桿菌及與腸桿菌科其他細(xì)菌差異比較

高建新，傅松哲，龍慧,肖菊珍

（南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌330038）

為進(jìn)一步推動(dòng)乳品企業(yè)對(duì)每批次嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行阪崎腸桿菌出廠(chǎng)檢驗(yàn)，尋求準(zhǔn)確，更加便捷、且檢測(cè)費(fèi)用低廉的檢測(cè)方法。選擇3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用進(jìn)行了研究，分離阪崎腸桿菌并對(duì)幾種常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌在5種腸道分離培養(yǎng)基上生物學(xué)特性反應(yīng)差異比較，以及對(duì)3種方法所用的培養(yǎng)基分離鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明,3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用，觀察其不同形態(tài)特征及生物學(xué)特性反應(yīng)后，可初步判別阪崎腸桿菌及腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種。3種用于分離鑒定阪崎腸桿菌方法，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該方法分離崎腸桿菌準(zhǔn)確、操作便捷、且檢測(cè)費(fèi)用低廉，有利于乳品企業(yè)對(duì)每批次產(chǎn)品進(jìn)行阪崎腸桿菌監(jiān)控。

阪崎腸桿菌；腸桿菌科細(xì)菌；生物學(xué)特性差異比較

0 引言

在嬰幼兒配方乳粉中，腸桿菌科其他病原體也常有檢出，1988年Muytjens等報(bào)告說(shuō)，來(lái)自35個(gè)國(guó)家的嬰幼兒配方乳粉中受的腸桿菌科細(xì)菌污染的占52.5%[2]。其中阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌的分離頻率最高[3]。

2003年，由Druggan-Forsythe-艾弗森發(fā)明了DFI顯色培養(yǎng)基[4]，該培養(yǎng)基利用5-溴-4-氯-3吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷，使阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出藍(lán)綠色反應(yīng)。2007年艾弗森和Forsythe發(fā)現(xiàn)由于α-葡萄糖苷酶基因的變異，阪崎腸桿菌菌株也可以不表達(dá)α-葡萄糖苷酶活性[5]。

由于顯色培養(yǎng)基的局限性，本研究選擇伊紅美藍(lán)、麥康凱、山梨醇麥康凱3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用進(jìn)行了研究，分離阪崎腸桿菌以及對(duì)幾種常見(jiàn)腸桿菌科細(xì)菌在5種分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況及生物學(xué)特性反應(yīng)差異進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC295444，ATCC29004，CMCC45401，大腸埃希菌ATCC25922，陰溝腸桿菌CMCC45501，肺炎克雷伯氏菌CMCC46114，檸檬酸桿菌CMCC48021，變形桿菌CMCC49027，沙門(mén)氏菌ATCC50662，志賀氏菌CMCC51573。阪崎腸桿菌（6株），聚團(tuán)腸桿菌NCCDC0919-21，非脫羧埃希氏菌NCCDC09190211菌株由本中心分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

伊紅美藍(lán)（EMB），麥康凱（MacConKey），山梨醇麥康凱（SorbitolMacConKey），微量生化管，結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA），顯色培養(yǎng)基（Xa-GicA、DFI）。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測(cè)分離鑒定

（1）樣品修復(fù)培養(yǎng)（前增菌）。無(wú)菌稱(chēng)取100 g乳粉加入500 mL預(yù)熱45℃BP中，混勻，經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)18-24 h。

（2）樣品腸道增菌培養(yǎng)。移取10 mL加入90 mL EE肉湯中，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。

（3）樣品分離培養(yǎng)。取EE增菌肉湯培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線(xiàn)接種EMB，MacConKey，Sorbitol-MacConKey瓊脂平板各1塊，置36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。觀察3種平板上的菌落形態(tài)及不同的生物學(xué)特性反應(yīng)。

（4）生化鑒定。挑取單個(gè)可疑菌落分純或接種TSA鈄面，生化鑒定至種。

1.2.2 生物學(xué)特性反應(yīng)差異比較

取本中心分離鑒定菌株及幾種常見(jiàn)腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物，分段劃線(xiàn)于5種腸道分離培養(yǎng)基，對(duì)其形態(tài)及生物學(xué)特性反應(yīng)差異比較。

1.2.33 種方法分離鑒定比較

應(yīng)用行標(biāo)、國(guó)標(biāo)及本研究方法，對(duì)市場(chǎng)嬰幼兒配方乳粉抽檢，分離鑒定乳粉中阪崎腸桿菌，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分折。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基上生物學(xué)特性

（1）阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，菌落較大，相鄰菌落之間易于融合。在MacConKey瓊脂平板上大小1.8～2.5 mm，呈淡粉色。在Sorbitol-MacConKey瓊脂平板上不發(fā)酵山梨醇，形成中等大小、圓形突起、邊緣整齊的淡黃色菌落。

（2）阪崎腸桿菌形態(tài)與染色。革蘭氏染色鏡檢為G一無(wú)芽孢短小桿菌，呈球桿狀或成對(duì)排列,有時(shí)亦可呈短鏈狀。

（3）阪崎腸桿菌生化特性。菌株觸酶陽(yáng)性、氧化酶陰性、動(dòng)力陽(yáng)性、葡萄糖代謝類(lèi)型(0/F)為發(fā)酵型(F)，IMViC：靛基質(zhì)-MR-VP+檸檬酸鹽+，在TSA鈄面上產(chǎn)黃色色素。做進(jìn)一步生化鑒定，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株進(jìn)一步生化鑒定結(jié)果

2.2 在5種分離培養(yǎng)基上生物學(xué)特性比較

阪崎腸桿菌與幾種常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌在5種分離培養(yǎng)基上形態(tài)與的生物學(xué)特性比較表明；阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，在MacConKey瓊脂平板上呈淡粉色，在SorbitolMacConKey瓊脂平板上不發(fā)酵山梨醇，中等大小、圓形突起的淡黃色菌落。聚團(tuán)腸桿菌與阪崎腸桿菌同屬于腸桿菌屬，在Mac-ConKey和SorbitolMacConKey平板上菌落形態(tài)與生物學(xué)特點(diǎn)與阪崎腸桿菌很相似，也同樣可產(chǎn)生黃色色素，但在EMB平板上有明顯差異，菌落呈紫紅色，邊緣整齊圓形突起，菌落約1.8～2.3 mm。陰溝腸桿菌在SorbitolMacConKey平板上呈發(fā)酵山梨醇紅色菌落，肺炎克雷伯氏菌在EMB平板上有黏液，在MacConKey和SorbitolMacConKey瓊脂平板上呈粉紅色、紅色菌落，大多數(shù)中間有黃色色素。大腸埃希菌在EMB平板上呈紫綠色,有金屬光澤,有黑心，沙門(mén)氏菌在EMB、Mac-ConKey均為無(wú)色，但在SorbitolMacConKey平板上呈紅色。志賀氏菌在這3種基礎(chǔ)分離培養(yǎng)基上為無(wú)色、細(xì)小，約1.0 mm。變形桿菌在EMB、MacConKey有遷延生長(zhǎng)現(xiàn)象。Xa-GiaA、DFII二者為顯色培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在此培養(yǎng)基上呈藍(lán)綠色反應(yīng)。但非脫羧埃希氏菌也有藍(lán)綠色反應(yīng)。如表2所示。

2.3 3種方法所用分離培養(yǎng)基結(jié)果比較

2008年對(duì)市場(chǎng)抽檢的39件嬰幼兒配方乳粉應(yīng)用3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基與SN/T1632.1-2005行標(biāo)所用Xa-GicA培養(yǎng)基，同時(shí)檢出陽(yáng)性2件，陽(yáng)性率5.13%。2009年對(duì)市場(chǎng)抽檢的23的件嬰幼兒配方乳粉，檢出陽(yáng)性2件,陽(yáng)性率8.70%。2010年1月～9月，對(duì)市場(chǎng)抽檢的27的件嬰幼兒配方乳粉，檢出陽(yáng)性2件,陽(yáng)性率7.40%。3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用與國(guó)標(biāo)推薦所用DFI培養(yǎng)基及行標(biāo)推薦所用Xa-GicA培養(yǎng)基，3種方法所用培養(yǎng)基檢測(cè)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

表2 幾種常見(jiàn)腸桿菌科細(xì)菌在5種分離培養(yǎng)基上生物學(xué)特性反應(yīng)差異比較結(jié)果

表3 3種方法檢測(cè)阪崎腸桿菌結(jié)果比較

4 討論

（1）從嬰幼兒配方乳粉中分離腸道致病菌，第1個(gè)步驟對(duì)樣品進(jìn)行修復(fù)培養(yǎng)。乳粉在生產(chǎn)加工過(guò)程中，致病菌易受到亞致死性損傷，緩沖蛋白胨水（BP）是由胨、肽氨基酸組成的緩沖體系，易于進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，有促進(jìn)細(xì)菌修復(fù)生長(zhǎng)的作用[6]。

（2）第2個(gè)步驟是腸道增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)基靈敏度高，分離培養(yǎng)目標(biāo)菌的機(jī)率就大。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室應(yīng)用3種阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，對(duì)兩種腸道增菌培養(yǎng)基(mLST-Vm、EE）進(jìn)行增菌效果比較，經(jīng)10倍稀后，阪崎腸桿菌1個(gè)cfu的條件下，兩種增菌培養(yǎng)基增菌效果無(wú)差異。選擇EE腸道增菌肉湯培養(yǎng)便捷，滅菌后2～8℃冰箱保存，4周之內(nèi)可以使用[7]。

（3）在分離培養(yǎng)基選擇上應(yīng)選用弱選擇性和強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基各1種或鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，增加分離平板的種類(lèi)。我們選擇3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用，凡腸桿菌科的細(xì)菌都能在此平板上生長(zhǎng)，并能觀察其不同菌落形態(tài)特征及生物學(xué)特性反應(yīng)，可初步判別腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種。EMB為弱選擇性培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色不規(guī)則粘液狀，此平板作為輔助觀察，不宜在此平板上挑取單個(gè)菌落。MacConKey為選擇性分離培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌在MacConKey瓊脂平板上呈邊緣整齊1.8～2.5 mm，淡粉色菌落，應(yīng)用MacConKey平板可觀察腸桿菌科細(xì)菌乳糖發(fā)酵情況。SorbitolMacConKey可以作為鑒別培養(yǎng)基，阪崎腸桿菌有不分解山梨醇的特性，挑取菌落應(yīng)選擇在SorbitolMacConKey上淡黃色或無(wú)色菌落。經(jīng)應(yīng)用結(jié)果表明；3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用，可選擇性分離到腸桿菌科的種，可初步判別腸桿菌科中不同的屬以及同屬不同種，再進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定。

（4）Xa-GiaA、DFI培養(yǎng)基，二者為顯色培養(yǎng)基。利用阪崎腸桿菌具有a-D-葡萄糖苷酶，在培養(yǎng)基中添加5-4氯-3-吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷，阪崎腸桿菌在此顯色培養(yǎng)基上呈藍(lán)綠色反應(yīng)，優(yōu)點(diǎn)是菌落區(qū)分直觀，但也并不是唯一性的阪崎腸桿菌所具有的生物學(xué)特征。羅茂凰報(bào)道：痢疾志賀菌、非脫羧埃希氏菌，熒光假單胞希菌在Xa-GiaA平板上能產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)，陸崢也報(bào)道福氏志賀菌也同樣可產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)。

（5）3年來(lái)使用3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用分離阪崎腸桿菌，準(zhǔn)確、便捷，且檢測(cè)費(fèi)用低廉。按每個(gè)平板17 mL量計(jì)算，行標(biāo)所用Xa-GiaA培養(yǎng)基平板價(jià)格35.42/個(gè)，國(guó)標(biāo)所用DFI培養(yǎng)基平板價(jià)格20.32/個(gè)，我們選擇3種基礎(chǔ)腸道分離培養(yǎng)基組合應(yīng)用，3塊平板價(jià)格共0.82元，更有利于乳品企業(yè)對(duì)每批次產(chǎn)品進(jìn)行阪崎腸桿菌監(jiān)控。

[1] IVERSEN C.FORSYTHE S J.Risk profile of Enterobacter sakazakii,an emergent pathogen associated with infant milk formula[J].Trends of Food Science and Technology,2003,14:443–454.

[2] MUYTJENS H L,ROELOFS-WILLEMSE H，JASPAR G H.Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae.[J]J.Clin.Microbiol.1988,26,743–746.

[3] ESTUNINGSIH S,KRESS C,Hassan A A,et al.Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula manufactured in Indonesia and Malaysia[J].J.Food Prot,2006,69,3013-3017

[4] DRUGGAN P,FORSYTHE S J,IVERSEN C.The Druggan-Forsythe-Iversen agar(DFI),a chromogenic medium for the detection fo Enterobacter sakazakii.104th ASM General Meeting,New Orleans,LA.2004.

[5] IVERSEN C,FORSYTHE S J.Comparison of media for the isolation of Enterobacter sakazakii[J],Appl Environ Microbiol,2007,73(1):48-52.

[6] 高建新.盧兆蕓.肖菊珍.奶粉中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37（5）：40-43.

[7] 高建新.陳海嬰.盧兆蕓.奶粉中一株阪崎腸桿菌的分離鑒定[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37（1）：105-106.

[8] 中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).SN/T1632.1-2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法第1部分：分離與計(jì)數(shù)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[9] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB4789.40-2010食品微生物檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

Application of three cost-effective medium for the detection of Enterobacteriaceae

GAO Jian-xin,FU Song-zhe,LONG Hui,XIAO Ju-zhen
(Nanchang Center for disease control and prevention,Nanchang,330038)

Objective:To further promote the monitoring of Enterobacter sakazakii for each batch of infant formula,accurate,convenient,and low-cost detection method was developed.Methods:three kinds of culture media were combined to isolate E.sakazakii.Enterobacteriaceae and several common intestinal bacteria were cultured in 5 kinds of mediums,their biological characteristics were compared,the three methods(line standard,national standard,this method)were also compared with results of isolation and identification media.Results:Through the combination of eosin-methylene-blue,MacConkey and sorbitol-MacConkey media，the morphological and biological characteristics of different media was also observed.Based on these isolation mediums,Enterobacteriaceae can be distinguished into different genera and different species.Three methods used for isolation and identification of E.sakazakii without significant difference(value U=0.1009，P=0.908＞0.05).The methods is accurate and low-cost,easily-operated,beneficial to monitoring E.sakazakii of every batch of dairy products.

Enterobacter sakazakii;Enterobacteriaceae;different biological characteristics

Q93-331，Q93-335

A

1001-2230（2011）02-0024-03

2010-09-25

高建新（1954-），女，副主任技師，從事乳制品及食品微生物檢測(cè)工作。