李艷，栗永樂(lè)，李傳娟，李秀麗，雙全，宮本拓

（1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018；2．岡山大學(xué)大學(xué)院自然科學(xué)研究科，日本岡山700-8530）

益生菌Lactobacillus helveticus 130B4在牛乳中的生長(zhǎng)特性及其促長(zhǎng)因子研究

李艷1，栗永樂(lè)1，李傳娟1，李秀麗1，雙全1，宮本拓2

（1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018；2．岡山大學(xué)大學(xué)院自然科學(xué)研究科，日本岡山700-8530）

將具有ACE抑制活性的乳酸菌Lactobacillus helveticus 130B4用于發(fā)酵乳制品中，研究其在還原脫脂乳中的生長(zhǎng)特性，并探討通過(guò)添加生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)對(duì)Lactobacillus helveticus 130B4生長(zhǎng)特性以及對(duì)ACE抑制活性的影響。結(jié)果表明,Lb.helveticus 130B4菌株在還原脫脂乳培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較緩慢，產(chǎn)酸能力較弱，37℃培養(yǎng)36 h后的pH值為4.31，酸度達(dá)0.8%，活菌數(shù)為8.93 g-1；72 h后的pH值為3.45，酸度可以達(dá)到1.85%，活菌數(shù)達(dá)9.1g-1；酵母浸膏、大豆肽、核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)對(duì)該菌株的產(chǎn)酸能力有一定的促進(jìn)作用。

發(fā)酵乳；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE抑制活性

0 引言

近年來(lái)發(fā)酵乳制品的醫(yī)療保健作用日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)多種發(fā)酵乳制品具有降血壓，抑制腫瘤等生理功能。在眾多的乳酸菌中，瑞士乳桿菌(Lb.helveticus)有較強(qiáng)的蛋白水解活性，能水解乳蛋白產(chǎn)生多種活性肽，其發(fā)酵乳具有較高的抗高血壓、抑制腫瘤、降低膽固醇等作用[1，2]。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）可以切除血管緊張素I的羧端His-Leu二肽，形成升血壓活性較強(qiáng)的多肽——血管緊張素II[3]，ACE將具有降壓功能的舒緩激肽降解,使之失去降壓作用[4]。而降壓肽能夠抑制ACE的活性，使血管舒張,起到降血壓作用[5]。本文將Lb.helveticus 130B4菌株用于發(fā)酵乳制品，探討了其在還原性脫脂乳的生長(zhǎng)特性，并通過(guò)添加促長(zhǎng)因子對(duì)Lb.helveticus 130B4生長(zhǎng)特性以及對(duì)ACE抑制活性的影響進(jìn)行研究，為生產(chǎn)降血壓的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株Lb.helveticus 130B4。

脫脂乳粉；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine，HHL）及鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde,OPA）；酵母浸膏，大豆肽，核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)（腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株的活化和發(fā)酵乳的制備

將瑞士乳桿菌凍干粉在無(wú)菌操作條件下，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至渾濁，并轉(zhuǎn)接3次進(jìn)行活化。

將活化好的菌種轉(zhuǎn)接100 g/L(質(zhì)量濃度)的滅菌脫脂乳中；37℃培養(yǎng)0，12，24，36，48，72 h后分別取樣測(cè)定其pH值、滴定酸度、活菌數(shù)蛋白水解活力和ACE抑制率。

1.3 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[6]。

1.4 pH值的測(cè)定

用經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)室PHSJ-4A型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 酸度的測(cè)測(cè)定

采用NaOH滴定法[7]。

1.6 Lb.helveticus 130B4的蛋白質(zhì)分解活性

蛋白質(zhì)分解活性是指脫脂乳培養(yǎng)基中通游離的表皮生長(zhǎng)因子的氨基酸和寡肽的增加量，參考Church的鄰苯二甲醛（OPA）方法[8]

1.7 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性性

測(cè)定參照在Cushman等[9]方法并根據(jù)具體情況進(jìn)行了一定的修改，具體方法如下：

取40 μL樣品，與濃度為10 mmol/L的HHL作底物的0.1 mol/L硼酸緩沖液（濃度為0.3 mol/L的NaCl,pH值為8.3）40 μL混合，在(37士0.5)℃恒溫水浴中預(yù)熱3 min,后加人40 μL ACE酶液（0.01 U/mL），將混合液在37℃保溫30 min,然后在沸水浴中加熱10 min，再加入180 μL濃度為0.01 mol/L的EDTA溶液。同時(shí)用40 μL的硼酸緩沖液（pH值為8.3）替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組。HPLC色譜分析條件：4.6 mm×150 mm ZORBAX-C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm；流速為1.5 mL/min；上樣量：20 μL，自動(dòng)進(jìn)樣；洗脫液：超純水-乙腈(75%:25%，各含0.3%的冰醋酸)；柱溫為30℃。ACE受到抑制會(huì)使馬尿酸的產(chǎn)量減少，以馬尿酸產(chǎn)量相對(duì)于空白實(shí)驗(yàn)減少的百分率代表ACE抑制活性。ACE抑制活性計(jì)算公式為

ACE抑制活性=〔（Cc-Cs）/(Cc-Cb)〕×100%，

式中：Cc為不含樣品，但含有ACE溶液中馬尿酸的峰面積，即對(duì)照；Cs為含有樣品和ACE溶液中馬尿酸的峰面積；Cb為樣品與ACE都不存在時(shí)溶液中馬尿酸的峰面積，即空白。抑制50%的ACE活性所需抑制劑的濃度記為IC50

1.8 Lb.helveticus 130B4促長(zhǎng)因子的探討

據(jù)報(bào)道在脫脂乳培養(yǎng)基中添加氨基酸和核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)時(shí)可以促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)[10，11]。本文選擇氨基酸和寡肽含量較多的酵母浸粉、大豆肽以及腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤等核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)按一定量分別添加到脫脂乳培養(yǎng)基中，接種Lb.helveticus 130B4后測(cè)定不同發(fā)酵階段的pH、酸度、蛋白質(zhì)分解活性和ACE抑制活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 Lb.helveticus 130B4還原脫脂乳的生長(zhǎng)特性

將Lb.helveticus 130B4在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行3代活化后，按1.0%的量接種到10%的還原脫脂乳，在37℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)0，12，24，36，48，72 h后對(duì)其pH值、滴定酸度、活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 Lb.helveticus 130 B4還原脫脂乳的生長(zhǎng)特性

圖1中，Lb.helveticus 130B4菌株在還原脫脂乳培養(yǎng)基中生較緩慢，在培養(yǎng)到24 h的時(shí)候，pH值為5.20，生成底物酸度僅為0.39%，培養(yǎng)至36 h的酸度達(dá)0.8%，72 h后可以達(dá)到1.85%。

2.2 Lb.helveticus 130B4生育性及添加促長(zhǎng)因子的影響

將活化了的Lb.helveticus 130B4菌種分別接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%酵母浸膏、1.0%大豆肽和5 g/100 L核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)（腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤）的10%還原脫脂乳培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)0，12，24，36，48，72 h后對(duì)其pH值、滴定酸度變化，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可以看出，酵母浸粉、大豆肽添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%還原脫脂乳培養(yǎng)基中，可以促進(jìn)Lb.helveticus 130B4的生酸性。如，培養(yǎng)24 h后pH值為5.2，酸度為0.39%；添加酵母后pH值為4.85，酸度為0.62%；大豆肽添加后pH值為4.68，酸度為0.96%。這種酵母和大豆肽中含有游離的氨基酸和寡肽類(lèi)活性物質(zhì)，可以提供Lb.helveticus 130B4增殖所需的營(yíng)養(yǎng)成份。在培養(yǎng)了48 h后，添加了酵母和大豆肽的培養(yǎng)液和沒(méi)有添加的是有一定的區(qū)別的。

圖2 Lb.helveticus 130B4的pH值及添加促長(zhǎng)因子的影響

圖3 Lb.helveticus 130B4的生酸性及添加促長(zhǎng)因子的影響

核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)包括腺嘌呤（Adenine）、鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黃嘌呤（Xanthine），黃嘌呤對(duì)Lb.helveticus 130B4的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。對(duì)照培養(yǎng)24 h和培養(yǎng)36 h圖示的pH值和酸度有較大的差別。在Lb.helveticus 130B4培養(yǎng)的初期階段，其蛋白的分解能力較弱，黃嘌呤的生長(zhǎng)促進(jìn)作用也較弱，培養(yǎng)48 h后，以降解瑞士乳桿菌而分解生成生長(zhǎng)的必要物質(zhì)十分充足，因而反應(yīng)也趨于完善。

2.3 Lb.helveticus 130B4的蛋白質(zhì)分解活性

使用Lb.helveticus 130B4菌株，將質(zhì)量濃度為5 g/100 L的腺嘌呤（Adenine）、鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黃嘌呤（Xanthine）4種核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的酵母浸粉和1.0%的大豆肽分別添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的還原脫脂乳培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，培養(yǎng)12，24，36，48，60，72 h后，測(cè)定得到的氨基酸、寡肽類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖4所示。

由圖4可以看出，24 h之內(nèi)，由于添加的酵母和大豆肽中含有游離的氨基酸和寡肽類(lèi)活性物質(zhì)，所以吸光值較添加核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)高,培養(yǎng)12 h后，在培養(yǎng)基中添加了腺嘌呤、黃嘌呤后產(chǎn)生的氨基酸和寡肽類(lèi)物質(zhì)含量急速增加，24 h到36 h時(shí)間內(nèi)則都以倍數(shù)增加。酵母浸粉、大豆肽及核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)加入Lb.helveticus 130B4菌株的發(fā)酵乳中，其產(chǎn)生的分解活性可以促進(jìn)的Lb.helveticus 130B4分解。其中，黃嘌呤對(duì)Lb.helveticus 130B4分解活性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

2.4 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

具有ACE抑制活性也是Lb.helveticus 130B4重要特性之一，由于黃嘌呤對(duì)Lb.helveticus 130B4的生長(zhǎng)特性有較強(qiáng)的促進(jìn)性，所以添加質(zhì)量濃度為5 g/100 L黃嘌呤到10%還原脫脂乳培養(yǎng)基中，Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性的調(diào)節(jié)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，還原脫脂乳培養(yǎng)基中添加黃嘌呤后，ACE制活性明顯增強(qiáng)，在培養(yǎng)48 h活性達(dá)到64.27%，比沒(méi)添加時(shí)ACE抑制活性提高了14.75%。添加黃嘌呤可使乳酸菌的蛋白質(zhì)分解能力增強(qiáng)，發(fā)酵乳中的游離氨基酸和寡聚肽的含量增多，培養(yǎng)液中具有ACE抑制活性的短肽含量也隨之增多。

圖4 游離氨基酸、肽類(lèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化（OD）

3 結(jié)論

圖5 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

將Lb.helveticus 130B4菌株接種于還原性脫脂乳培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，生長(zhǎng)較緩慢，產(chǎn)酸能力較弱，36 h后的pH值為4.31，酸度達(dá)0.8%，活菌數(shù)8.93 g-1；72 h后的pH值為3.45，酸度可以達(dá)到1.85%，活菌數(shù)達(dá)9.1g-1；酵母浸粉、大豆肽、核酸關(guān)聯(lián)物質(zhì)對(duì)該菌株的產(chǎn)酸能力有一定的促進(jìn)作用。發(fā)酵液中游離氨基酸含量明顯較沒(méi)添加時(shí)增多，24 h到36 h時(shí)間內(nèi)則都以倍數(shù)增加；還原脫脂乳培養(yǎng)基中添加黃嘌呤后，ACE抑制活性明顯增強(qiáng)，在培養(yǎng)48 h活性達(dá)到64.27%，比沒(méi)添加時(shí)ACE抑制活性提高了14.75%。

[1] YARNAMOTO N，AKINO A，TAKANO T.Antihypertensive Effect of the Peptides Derived from Casein by an Extracelluar Proteinase frorn Lactobacillus helveticus CP790[J].J.Dairy Sci，1994,77:917-922.

[2] MAENO M，YAMAMOTO N，TAKANO T.Identification of an Antihypertensive Peptide from Casein Hydrolysate Produced by a Proteinase from Lactobaeillus helveticus CP790[J].J.Dairy Sci，1996，79:1316-1321.

[3] 襲岳亭.生物活性肽——結(jié)構(gòu)與功能[M].上海：上海技術(shù)出版社，1985.

[4] NAKAMURA Y,YAMAMOTO N,SAKAI K,et al.Antihypertensive Effect of Sour Milk and Peptidesisolated from It that are Inhibitors to Angiotensin-I-Converting Enzyme[J].Journal of Dairy Science,1995,78(4):1253-1257.

[5] 周潔，鄒繼紅，袁杰利.具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性益生菌篩選的研究進(jìn)展[J].Chinese Journal of Microecology,2008，70:604-606.

[6] 郝林.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001：29-30.

[7] 王叔淳,崔圣堯,張秀毫.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)[M]。北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1996:156-157.

[8] FRANKC，CHURCH，HAROLDE，SWAISGOOD.Spectrophotomet-Ric Assay Using o-Phthaldialdahyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins[J].J Dairy Sci,66:1219-1227.

[9] CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric Assay and Properties of the Angiotenxin-Converting Enzyme of Rabbit Lung[J].Pharmacol,1971,20:1637-1648.

[10] 中島昭正.脫脂乳へのアミノ酸添加が乳酸菌の酸生成に及ぼす效果日本家政學(xué)會(huì)誌47(11):1085-1091,1996.

[11] 中島昭正.脫脂乳への核酸關(guān)連物質(zhì)の添加が乳酸菌の酸生成に及ぼす效果.日本家政學(xué)會(huì)誌48(1):11-18,1997.

Study on the growth characteristics and promoting growth factors of probiotic Lactobacillus helveticus 130B4 in milk

LI Yan1,LI Yong-le1,LI Chuan-juan1,LI Xiu-li1,SHUANG Quan1,MIYAMOTO TAKU2
(1.College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China；2.Okayama University School of Natural Science and Technology Japan Okayama 700-8530）

ACE inhibitory activity of lactic acid bacteria Lactobacillus helveticus 130B4 was used in fermented dairy products,in order to reseach the growth characteristics,the growth characteristics and ACE inhibitory activity of Lactobacillus helveticus 130B4 were studied by the addition of growth promoting substances.The results showed that Lb.helveticus 130B4 in skim milk was growing slowly and weak acid,37℃for 36 h,the pH was 4.31,the acidity was 0.8%,the viable count was 8.93 g-1;after 72 h,the pH was 4.31,the acidity was 1.85%,the viable count was 9.1 g-1;the acid production ability of this strain could be promoted by Yeast leaching powder、Soybean peptide and nucleic acid related material

fermented milk；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE inhibitory activity

Q935

A

1001-2230（2011）02-0006-03

2010-10-22

李艷（1984-），女，碩士，從事乳品生物技術(shù)方面的研究。通訊作者：雙全