張莉，李慶章，田雷，崔英俊，趙冰，呂英，高學軍，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

人α-乳白蛋白在奶牛乳腺上皮細胞中的表達

張莉，李慶章，田雷，崔英俊，趙冰，呂英，高學軍，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

將人α-乳白蛋白（α-LA）0.76 kb的cDNA序列連接到PSV載體SV40啟動子后，構建真核表達載體hα-LA–psv。將構建的真核表達載體轉染奶牛乳腺上皮細胞，人α-乳白蛋白的表達量約為0.85 g/L。結果表明，構建的真核表達載體能夠在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞中高效表達人α-乳白蛋白。

人α-LA；基因表達；奶牛乳腺上皮細胞

0 引言

牛乳和人乳在組成上是有差別的，人乳蛋白主要是乳清蛋白，約占總蛋白的70%，其他的為酪蛋白，而牛乳蛋白主要是酪蛋白，約占總蛋白的78.8%，乳清蛋白含量低，所以改良牛乳的蛋白組成和含量，使之更接近于人乳，會提高牛乳的營養(yǎng)價值[1]。α-乳白蛋白是一種主要的乳清蛋白，具有調節(jié)產(chǎn)乳的功能[2]，還有細胞溶解活性[3]、誘導細胞生長抑制和細胞凋亡[4]等多種功能。使用基因重組技術在細胞和轉基因動物中表達α-乳白蛋白的研究目前只是在小鼠、大鼠和豬體內進行，在反芻動物中還未見報道。本研究是在奶牛乳腺上皮細胞中進行人α-乳白蛋白的表達研究，為以后制備轉基因牛乳腺反應器，生產(chǎn)含人α-乳白蛋白的轉基因牛奶，進行前期基礎研究。

1 實驗

1.1 材料

hα-LA-cDNA-T菌株與初步培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞（來自本實驗室），菌株JM109，pGEM-T載體，pSV-Galactosidase Control載體，TfxTM-20真核轉染試劑，限制性內切酶，T4 DNA連接酶，膠回收試劑盒，去內毒素質粒提取試劑盒，F(xiàn)12培養(yǎng)基，角蛋白18抗體，鼠抗人alpha lactalbumin單克隆抗體（IgM），辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgM二抗，ECL發(fā)光液。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建及鑒定

大量提取hα-LA-cDNA-T質粒和pSV載體質粒，將它們用PstI和AgeI 37℃水浴雙酶切3 h后，分別純化回收0.76 kb的人α-乳白蛋白和3.55 kb的pSV黏性末端片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶22℃水浴連接4 h后，轉化JM109感受態(tài)細菌，挑選陽性克隆，搖菌擴增后提取質粒，進行雙酶切鑒定。將經(jīng)雙酶切鑒定的陽性重組子命名為hα-LA–psv，質粒于-20℃保存?zhèn)溆?，并?70℃保存菌種。

1.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定

初步培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞，加入質量分數(shù)為15%DF12完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶消化敏感性不同，在混合生長的細胞培養(yǎng)物中，用質量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶37℃消化，待成纖維細胞細胞質回縮，脫離瓶壁時，終止消化，將酶液傾出，換完全培養(yǎng)液，經(jīng)2～3次如此選擇傳代后，即可得到純化的牛乳腺上皮細胞。應用免疫熒光細胞染色法，使用激光共聚焦顯微鏡對純化后的牛乳腺上皮細胞角蛋白18的表達進行檢測。

1.2.3 細胞轉染

將純化的奶牛乳腺上皮細胞以2×104/cm2的濃度接種12孔培養(yǎng)板，待細胞80%連生時，按照TfxTM-20說明書上的方法將重組質粒hα-LA-psv轉染牛乳腺上皮細胞。

1.2.4 人α-乳白蛋白的Western Blot檢測

將轉染72 h的細胞，小心傾去培養(yǎng)液，加入裂解液裂解15 min后，再加入等量的2×SDS上樣緩沖液備用。SDS-PAGE電泳后，切取11～17 ku之間的部分，20V轉膜17 min，5%的脫脂奶粉封閉1h，按1∶600比例加入一抗，室溫混勻后，4℃過夜；TBST洗膜3次（每次5 min），按1∶2000的比例加入二抗，37℃作用1 h，TBST洗膜3次（每次6 min），加入ECL發(fā)光液作用2～3 min，曝光1～3 min，顯影30～50 s，水洗后，定影。掃描儀掃描結果后，Image-Pro Plus 5.0分析蛋白區(qū)帶，估算蛋白表達量。同時切取34～43 ku之間部分做GAPDH內參（36 ku），20 V轉膜50 min，檢測。

2 結果

2.1 真核表達載體的構建及鑒定

將提取的PSV質粒用AgeI和PstI大量雙酶切，將切去質粒SV40啟動子后的β-半乳糖苷酶基因全部片斷余下的3.55 kb的黏性末端片段膠回收純化。純化后的片段與hα-LA-cDNA-T質粒用AgeI和PstI大量雙酶切純化后的0.76 kb的人α-乳白蛋白黏性末端片段進行連接，得到真核表達載體hα-LA–psv。雙酶切鑒定結果，分別對應于hα-LA-cDNA和PSV（去β-半乳糖苷酶基因全部片斷）的大小，與預期結果一致，如圖1所示，證實hα-LA-cDNA序列與PSV載體成功重組。

圖1 重組子hα-LA-psv的雙酶切鑒定圖譜

2.2 奶牛乳腺上皮細胞的純化和鑒定

純化培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞（圖2（a）），用免疫熒光細胞染色法檢測角蛋白18的表達，使用激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果（圖2（b）），同時用本實驗室純化的成纖維細胞作陰性對照（圖2（c））。圖中紅色的為PI標記的細胞核，綠色的為FITC標記的角蛋白18，結果說明得到的細胞是乳腺上皮細胞。

圖2 奶牛乳腺上皮細胞的純化和鑒定

2.3 細胞轉染及表達產(chǎn)物的檢測

轉染72 h的牛乳腺上皮細胞裂解液，用Western Blot方法檢測到了人α-乳白蛋白表達，掃描儀掃描結果后（圖3），用Image-Pro Plus 5.0分析蛋白區(qū)帶，估算得轉染72 h的細胞中人α-乳白蛋白的表達量約為0.85 g/L。

圖3 轉染72 h人α-LA基因表達檢測

3 討論

利用轉基因技術改善乳成分，在通過牛乳生產(chǎn)人乳中的一些成分改善牛乳品質方面被認為有抑菌、殺菌作用和有助于嬰兒鐵的更新及鐵向黏膜細胞轉運的人乳鐵蛋白轉基因牛已經(jīng)研究成功，荷蘭Gen Pharm公司用轉基因牛生產(chǎn)人乳鐵蛋白，預計每年從乳中提煉出營養(yǎng)奶粉的價值為50億美元[5]。α-乳白蛋白被認為是乳糖合成酶的一個亞基，控制著乳中乳糖的含量，理論上如果乳腺能夠合成更多的乳糖，產(chǎn)乳的體積也會有相應比例的增加。因此，增加乳中α-乳白蛋白的含量很有價值。目前已有研究將牛α-乳白蛋白基因在轉基因豬和轉基因小鼠中進行了表達，結果均引起了乳產(chǎn)量的增加[6，7]。另外，乳腺上皮細胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，是制作乳腺生物反應器的靶細胞，因此可以利用體外培養(yǎng)的、能合成和分泌乳蛋白的乳腺上皮細胞來檢測特異性表達載體的功能，具有方便、快捷且真實反映乳腺在體內表達水平的功能[8]。本實驗在純化鑒定的穩(wěn)定的奶牛乳腺上皮細胞中，進行了人α-乳白蛋白基因的表達研究，結果產(chǎn)生了具有活性的人α-乳白蛋白，為以后在牛乳中生產(chǎn)人α-乳白蛋白，增加乳中乳糖的含量和乳產(chǎn)量，提高牛奶的營養(yǎng)價值，進行了準備研究。試驗結果表明培養(yǎng)純化的牛乳腺上皮細胞能夠很好的表達外源基因，可進行相關的表達研究，可為以后制備乳腺生物反應器、研究泌乳機制及泌乳調控機制提供基礎。

[1] 汪玉松,鄒思湘.乳生物化學[M].長春：吉林大學出版社,1995.

[2] 劉思國,魏影允,胡國法,等.人α-乳白蛋白在轉基因小鼠乳汁中動態(tài)表達圖貌[J].中國科學：C緝,2003,33(4):317-322.

[3] MCKENZIE H A,WHITE F H,STINNAKRE M G,et al.Studies on a Trace Cell Lytic Activity Associated with Alpha-Lactalbumin[J].Biochem Int,1987,14(2):347-356.

[4] HAKANSSON A,ZHIVOTOVSKY B,ORRENIUS S,et al.Apoptosis Induced by a Human Milk Protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(17):8064-8068.

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[6] BLECK G T,WHITE B R,MILLER D J,et al.Production of Bovine Alpha-lactalbumin in the Milk of Transgenic Pigs[J].J Anim Sci,1998,76(12):3072-3078.

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Construction of human alpha lactalbumin expression vector and its expression in bovine mammary epithelial cells

ZHANG Li，LI Qing-zhang，TIAN Lei，CUI Ying-jun，ZHAO Bing，LV Ying，
GAO Xue-jun，JIANG Yu-jun
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The expression vector hα-LA–psv including human alpha lactalbumin 0.76 kb cDNA gene sequence was successfully constructed and transfected into the bovine mammary epithelial cells.The production of human alpha lactalbumin was 0.85mg/mL approximately.The results indicate that the expression vector can express alpha lactalbumin in bovine mammary epithelial cells effectively.

human α-LA；gene expression；bovine mammary epithelial cells

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0004-02

2010-10-15

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.11511027)；黑龍江省博士后基金(LBH-Z09270)；東北農(nóng)業(yè)大學博士科研啟動基金(190106)資助。

張莉（1978-），女，副教授，主要研究方向為泌乳生物學與乳腺功能調控。