崔維剛，薛 玲

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355)

憤怒情緒模型大鼠不同腦區(qū)γ氨基丁酸B2受體表達的變化

崔維剛，薛 玲

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355)

目的 通過檢測憤怒情緒模型大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬γ氨基丁酸B2受體(GABABR2)表達的變化，探索憤怒情緒與GABABR2的關(guān)系，以及中藥經(jīng)前平顆粒的干預(yù)機制。方法 采用居住入侵的方法復(fù)制憤怒情緒模型大鼠，然后用RT-PCR和Western Blot的方法檢測 GABABR2 mRNA和蛋白的表達差異。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠GABABR2 mRNA和蛋白的表達都明顯降低;與模型組相比，經(jīng)前平給藥組大鼠GABABR2 mRNA和蛋白的表達都顯著升高。結(jié)論 大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2表達降低可能是影響大鼠憤怒情緒的重要機制之一;中藥經(jīng)前平顆?？蓪?GABABR2表達異常變化起到調(diào)節(jié)作用。

憤怒情緒模型大鼠;頂區(qū)皮質(zhì);海馬;經(jīng)前平顆粒;γ氨基丁酸B2受體

情志內(nèi)傷是臨床諸多心身疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要因素。怒為七情五志之一，是引發(fā)相應(yīng)心身疾病的關(guān)鍵［1］。目前國內(nèi)外對 GABABR2調(diào)節(jié)情緒的研究多針對在焦慮和抑郁上，與憤怒情緒的關(guān)系罕有報道。本實驗通過復(fù)制憤怒情緒動物模型，經(jīng)前平顆粒給藥后，采用RT-PCR和Western Blot實驗技術(shù)研究了憤怒情緒模型大鼠頂區(qū)皮層和海馬mRNA及蛋白的表達，以及中藥經(jīng)前平顆粒對模型大鼠的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物

經(jīng)前平顆粒：秦皇島市山海關(guān)制藥廠生產(chǎn)，批號：07102501。

1.2 動物

SPF級健康SD雌性大鼠，體重180～220 g。由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［SCXK(魯)20050015］。

1.3 試劑

GABABR2抗體(Santa Cruz公司);預(yù)染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司);BeyoECL Plus(碧云天生物技術(shù)研究所);硝酸纖維素膜(美國PALL公司);RT-PCR所需引物由濟南博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Trizol總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(濟南朋遠生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);日本 TaKaRa的 rTaq(不含 dNTP Mixture)(濟南賽恩斯生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.4 儀器

電泳儀、轉(zhuǎn)印儀(美國 Bio-Rad公司);CT15RT臺式高速冷凍離心機(上海生美生化儀器設(shè)備工程有限公司);FR-980凝膠成像分析儀(上海復(fù)日科技有限公司);PCR擴增儀(TAKARA);電泳儀：DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.5 方法

SD大鼠27只，進入正式實驗前，稱量大鼠體重量，進行曠場行為學(xué)實驗，采集其基線水平數(shù)據(jù)。大鼠隨機分為3組，每組9只，造模組大鼠居住入侵造模［2］刺激10 d，正常對照組大鼠平行對照，造模給藥組大鼠造模同時給予經(jīng)前平10 g/kg灌胃，造模組及正常組大鼠10 mL/kg常水灌胃。造模完成后立即稱量3組大鼠體重量并進行曠場行為學(xué)測定，然后斷頭取腦，于冰上迅速剝離出頂區(qū)皮質(zhì)、海馬，分別放入1.5 mL離心管，置于液氮中迅速冷凍后保存于-70℃冰箱備用。

1.5.1 Western Blot［3］分析 GABABR2 的表達：取出海馬組織，冰浴中操作，按1∶5的比例(mg/μL)加入提前預(yù)冷的Ripa裂解液，勻漿器勻漿30 min，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清，采用Bradford法測定蛋白含量，其它加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×SDS，置于沸水中煮5 min使蛋白變性。以30 μg/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，分別與 GABABR2(1∶200，5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋)和 β-actin(1∶1500)的抗體室溫搖床孵育2 h，再與相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測雜交信號，顯影于X光片上，用凝膠成像分析儀在可見光透射下對X光片進行掃描和圖像分析。

1.5.2 RT-PCR［3］法分析 GABABR2 mRNA 的表達：GABABR2 引物序列：5′-CTG TGC TCT CTG TGA AGT TGC-3′，5′-CCA TCT GGC TTG GCA TTG TC-3′，產(chǎn)物長度 582 bp;用 β-actin作為內(nèi)參照(引物序列：5′-TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT C-3′，5′-CAT GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC A-3′)，產(chǎn)物長度265 bp。取出頂區(qū)皮質(zhì)組織，冰浴下操作，采用Trizol法抽提總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，所得樣品進行 PCR擴增。GABABR2擴增條件為：預(yù)變性94℃ 2.5 min，變性94℃ 1 min，退火 57℃ 40 s，延伸 72℃ 1 min，30 個循環(huán)，再72℃延伸7 min;β-Actin擴增條件為：預(yù)變性94℃ 2.5 min，變性 94℃ 1 min，退火 59℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，28個循環(huán)，再72℃延伸7 min;取 PCR擴增產(chǎn)物于100 V下在2%瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行光密度掃描，分析內(nèi)參及GABABR2 mRNA表達。

1.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及LSD法檢驗以統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠取材前曠場實驗得分

與正常對照組大鼠相比，造模組大鼠造模后曠場實驗的得分顯著增加;與造模組相比，經(jīng)前平給藥組大鼠曠場實驗得分顯著減少(圖1)。

2.2 Western Blot結(jié)果

Western Blot結(jié)果表明，憤怒情緒大鼠海馬及頂區(qū)皮質(zhì)中GABABR2均有表達。與正常對照組大鼠相比，憤怒情緒組大鼠海馬和頂區(qū)皮層的GABABR2蛋白表達顯著降低，這說明憤怒情緒的發(fā)生可能與大鼠海馬頂區(qū)皮質(zhì)GABABR2表達異常降低相關(guān)。與憤怒情緒組比較，經(jīng)前平給藥組大鼠兩腦區(qū)的GABABR2蛋白表達顯著升高，說明調(diào)肝方藥經(jīng)前平顆粒能改變GABABR2蛋白表達水平異常降低的狀態(tài)(圖 2，表 1)。

圖1 各組大鼠曠場得分比較(n=9)Fig.1 Effects of baseline and the model time of social stress on locomotor activity(n=9)

表1 三組大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2蛋白的相對表達量(n=9)Tab.1 GABABR2 protein relative levels in rat cerebral cortex regions and hippocampus of three groups(n=9)

圖2 三組大鼠頂區(qū)皮質(zhì)、海馬GABABR2蛋白的Western Blot結(jié)果Fig.2 Western Blot results of GABABR2 protein in cerebral cortex regions and hippocampus of three rat groups

圖3 三組大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2 mRNA表達Fig.3 GABABR2 mRNA expression from three groups rats of cerebral cortex regions and hippocampus

2.3 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果表明，憤怒造模組大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2的mRNA表達均明顯低于正常對照組;與憤怒情緒組比較經(jīng)前平顆粒給藥后兩腦區(qū)GABABR2的mRNA表達均顯著上升(圖3，表2)。

3 討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為怒為七情五志之一，是宣達人體氣機的一種方式，適度的怒不會危害人體健康。然而怒太過，則會導(dǎo)致臟氣損傷，產(chǎn)生病變。《素問·舉痛論》說：“怒則氣上”?！端貑枴け静≌摗氛f：“人或恚怒，氣逆上而不下，即傷肝也”。怒傷肝，肝氣上逆是怒致病的基本病機［4］。肝主疏泄，既藏有形之血，又疏無形之氣，調(diào)暢全身氣機，肝主疏泄是維持機體健康狀態(tài)極為重要的一環(huán)［5］。楊世忠等［6］將亞健康狀態(tài)責(zé)之于肝失疏泄，提出肝失疏泄可以引起精神情志改變、臟腑功能改變以及對氣血津液的影響等三方面的病理變化。中醫(yī)“肝主疏泄”理論認為憤怒、抑郁是肝疏泄失常的典型表現(xiàn)且二者聯(lián)系密切［7］。由于肝功能異常則易怒，怒又傷肝。因此對怒之為病，重在治肝。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為怒主要是通過引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的失調(diào)而致病的。憤怒情緒發(fā)生時，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮;內(nèi)分泌系統(tǒng)被激活，血中腎上腺皮質(zhì)激素、腎素血管緊張素、甲狀腺素、胰高血糖素、垂體后葉激素分泌增加，這些激素對肝臟和其它一些器官都有影響，從而引發(fā)了一系列的病癥［8］。而神經(jīng)遞質(zhì)亦與怒密切相關(guān)，作為調(diào)節(jié)焦慮和應(yīng)激行為的主要神經(jīng)遞質(zhì) γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是調(diào)節(jié)焦慮和應(yīng)激行為的主要神經(jīng)遞質(zhì)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于整個大腦的多種中間神經(jīng)元和投射神經(jīng)元，是一種潛在的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬等多個部位發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用，對神經(jīng)元的遷移、增殖、分化、其自身受體的基因表達以及神經(jīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成均有一定的調(diào)節(jié)作用［9］。GABA系統(tǒng)功能失調(diào)可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的異常和焦慮管理失調(diào)［10］。其中 GABA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要介導(dǎo)慢性抑制效應(yīng)，改變其亞基的功能易引起煩躁易怒和焦慮抑郁情緒。

經(jīng)前平顆粒主要由白芍、香附、川楝子、柴胡、川穹、枳殼、半夏、豆蔻、木香、甘草等中藥組成?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)方中白芍有明顯的鎮(zhèn)靜作用。白芍中的芍藥甙(TGP)1 mg靜脈注射給于大鼠，可見到輕度的鎮(zhèn)靜作用，白芍總甙分別加強嗎啡、可樂定抑制小鼠扭體反應(yīng)，提示 TGP有鎮(zhèn)痛作用［11］。柴胡中的柴胡皂苷和柴胡揮發(fā)油均有抗驚厥作用［12］。香附中所含的三萜類化合物鎮(zhèn)痛效果與乙酰水揚酸相當(dāng)。香附酮為較強的前列腺素生物合成抑制劑，故也是鎮(zhèn)痛作用的有效成分之一。香附的醇提物有鎮(zhèn)靜作用，使小鼠自發(fā)活動減少、遲緩，并可消除大鼠的條件性回避反射［13］。通過現(xiàn)代藥理表明，經(jīng)前平顆粒組方中的多種成分具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等作用，提示這些成分可能是經(jīng)前平顆粒對憤怒情緒發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比憤怒情緒模型大鼠的曠場試驗得分顯著升高，模型大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2蛋白和mRNA表達水平顯著降低，提示大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2蛋白和mRNA的低表達水平與憤怒情緒密切相關(guān)，經(jīng)前平顆粒能顯著改善模型大鼠的曠場試驗得分，提高大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬GABABR2蛋白和mRNA表達水平，表明該藥通過提高大鼠頂區(qū)皮質(zhì)和海馬中GABA受體表達水平而發(fā)揮療效。這無疑為經(jīng)前平顆粒的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)，同時也為研究憤怒情緒的病因提供了新的實驗依據(jù)。

表2 三組大鼠頂區(qū)皮質(zhì)、海馬GABABR2 mRNA的相對表達量(n=9)Tab.2 GABABR2 mRNA relative levels in rat cerebral cortex regions and hippocampus of three group(n=9)

［1］ 劉曉偉，曲宏達，張紅梅，等.怒、恐應(yīng)激大鼠腦內(nèi) c2 fos與CRHmRNA表達差異性分析［J］.四川中醫(yī)，2006，24(1)：11-13.

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Changes of γ-Aminobutyric Acid B2 Receptor in Different Brain Regions of Rats with Anger Emotion

CUI Wei-gang，XUE Ling
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Objective To research the relationship of anger model and γ-aminobutyric acid B2 receptor(GABABR2)，and the intervention mechanism of jingqianping granule by observing the differential expression of GABABR2 in anger emotional model rats of cerebral cortex regions and hippocampus.Methods The anger model was induced in rats by resident-intruder.We analyzed the expression of GABABR2 in cerebral cortex and hippocampus by Western Blot and RT-PCR.Results The expression of GABABR2 in cerebral cortex and hippocampus of model rats decreased obviously compared with the normal control group.Compared with the model group，the expression of GABABR2 increased after treated with Jingqianping graulne.Conclusion The Jingqianping granule can up-regulate the GABABR2 expression level of the model rats in cerebral cortex and hippocampus，which may be one of the mechanisms impacting rats with anger emotion.The expression changes of GABABR2 are tight related to rats with anger emotion.

Anger emotional rat model;Cerebral cortex regions;Hippocampus;Jingqianping granule; γaminobutyric acid B2 receptor

R285.5 R332

A

1671-7856(2011)03-0022-05

2010-07-10

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.006

國家自然科學(xué)基金重點項目(30930110);國家自然科學(xué)基金面上項目(30973688);山東省科技發(fā)展計劃項目(2006GGB02001)。

崔維剛(1986-)，男，碩士生，研究方向：中藥調(diào)肝方藥藥理研究。E-mail：sdws2004@163.com。

薛玲(1964-)，女，教授，研究方向：中藥調(diào)肝方藥藥理研究。E-mail：xxueling@163.com。