朱淼鑫，姚 明

(上海市腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)病理研究室，上海 200032)

小動(dòng)物活體成像技術(shù)的應(yīng)用

朱淼鑫，姚 明

(上海市腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)病理研究室，上海 200032)

小動(dòng)物活體成像技術(shù)在國(guó)內(nèi)外得到越來(lái)越多的普及應(yīng)用，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)特別是腫瘤研究的發(fā)展。本文就小動(dòng)物活體成像技術(shù)的原理、標(biāo)記方法和實(shí)際應(yīng)用做簡(jiǎn)單介紹。

熒光蛋白;熒光素酶;活體成像;模型，動(dòng)物

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因(Luciferase)標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)等熒光報(bào)告基因和 FITC、Cy5、Cy7等熒光素及量子點(diǎn)(quantum dot，QD)進(jìn)行標(biāo)記。小動(dòng)物活體成像技術(shù)是采用高靈敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，使得可以直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。實(shí)驗(yàn)者借此可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。由于具有更高量子效率CCD的問(wèn)世，使活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有越來(lái)越高的靈敏度，對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高;另外，該技術(shù)不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)等方面［1～3］。

1 小動(dòng)物活體成像概述

1.1 熒光發(fā)光成像

熒光成像的標(biāo)記對(duì)象較為廣泛，可以是動(dòng)物、細(xì)胞、微生物、基因，也可以是抗體、藥物、納米材料等。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(DsRed)及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似，熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［4］。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性效率高，近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。

雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。例如利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究，然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。

熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜EX(excitation spectrum)和激發(fā)光譜EM(emission spectrum)的不同，要選擇對(duì)應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射濾片。常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)見(jiàn)表1。

表1 常用熒光蛋白和熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)Tab.1 Common fluorescent protein and fluorescence dyes excitation and emission wavelength

1.2 生物發(fā)光成像

活體生物熒光成像技術(shù)是指在小的哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因-熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢?jiàn)光能釋放。然后在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子，成為某種基因的報(bào)告基因，通過(guò)監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)［5］。

生物熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)熒光，螢火蟲(chóng)熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過(guò)程中可以釋放波長(zhǎng)廣泛的可見(jiàn)光光子，其平均波長(zhǎng)為560 nm(460～630 nm)，這其中包括重要的波長(zhǎng)超過(guò)600 nm的紅光成分。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白是吸收可見(jiàn)光的主要成分，能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見(jiàn)光;水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對(duì)波長(zhǎng)為590～800 nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長(zhǎng)超過(guò)600 nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被高靈敏的CCD檢測(cè)到。

生物發(fā)光成像的優(yōu)點(diǎn)可以非侵入性，實(shí)時(shí)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程，從而可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，及降低個(gè)體間差異的影響;由于背景噪聲低，所以具有較高的敏感性;不需要外源性激發(fā)光，避免對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞造成損傷，有利于長(zhǎng)期觀察;此外還有無(wú)放射性等其他優(yōu)點(diǎn)。然而生物發(fā)光也有自身的不足之處：例如波長(zhǎng)依賴性的組織穿透能力，光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性也不盡相同，其中血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì);由于是在體外檢測(cè)體內(nèi)發(fā)出的信號(hào)，因而受到體內(nèi)發(fā)光源位置及深度影響;另外還需要外源性提供各種熒光素酶的底物，且底物在體內(nèi)的分布與藥動(dòng)力學(xué)也會(huì)影響信號(hào)的產(chǎn)生;由于熒光素酶催化的生化反應(yīng)需要氧氣、鎂離子及 ATP等物質(zhì)的參與，受到體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的影響。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

以移植性小鼠腫瘤模型活體成像為例，一個(gè)完整的成像過(guò)程包括構(gòu)建報(bào)告基因、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選、建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞、再將此細(xì)胞在體內(nèi)建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，進(jìn)而通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)特定部位所發(fā)出的光子信號(hào)，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理軟件獲得量化數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)圖像。也就是說(shuō)，選擇合適的報(bào)告基因與轉(zhuǎn)染方法至關(guān)重要。

熒光蛋白表達(dá)質(zhì)?？梢宰约簩?shí)驗(yàn)室構(gòu)建，也可以來(lái)源于其它實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)或市售。本文采用的真核表達(dá)質(zhì)粒eGFP-2A-CBGr99由德國(guó)癌癥研究中心Haemmerling教授惠贈(zèng)，全長(zhǎng)5929 bp，屬氨芐青霉素抗性選擇系統(tǒng)，帶有細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因Amp，在CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下可在真核細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)物為 GFP與 Luciferase雙表達(dá)［6］。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，陽(yáng)離子聚合物法，病毒介導(dǎo)法，Biolistic顆粒傳遞法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法，電穿孔法等，本文介紹比較常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體法和病毒介導(dǎo)法。2.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體法

2.1.1 細(xì)胞準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)染前1 d將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞鋪24孔板，每孔大約 l×105個(gè)細(xì)胞，預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)50% ～80%融合。

2.1.2 脂質(zhì)體/質(zhì)粒復(fù)合物的制備：1 μg質(zhì)粒稀釋于100 μL不含血清及抗菌素的 DMEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻;10 μL的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑稀釋于100 μL DMEM中，輕輕混勻;將100 μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，一邊滴加一邊混勻;室溫孵育30 min;將200 μL脂質(zhì)體/質(zhì)粒復(fù)合物添加到每孔中并輕輕搖動(dòng)使之混合;放置在37℃ 5%CO2孵育箱孵育36 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后一般隔天換液，培養(yǎng)液為含有 G418的DMEM培養(yǎng)基，以篩選抗性克隆，所含G418濃度從400 mg/L開(kāi)始。視情況每次換液時(shí)G418濃度增加(200～400)mg/L，到最高達(dá) 2000 mg/L，2～3周后熒光顯微鏡下挑選最亮克隆，將細(xì)胞克隆擴(kuò)增，可得GFP表達(dá)純度約為50% ～60%的細(xì)胞株，取少量細(xì)胞進(jìn)一步在6孔板中培養(yǎng)，每孔約10個(gè)細(xì)胞，待長(zhǎng)成克隆后再挑選單個(gè)表達(dá)GFP的細(xì)胞生成的克隆即可得到高純度的GFP陽(yáng)性細(xì)胞株。

2.2 慢病毒感染法

2.2.1 質(zhì)粒制備

2.2.1.1 質(zhì)粒準(zhǔn)備：收到溶解于濾紙上的質(zhì)粒eGFP-2A-CBGr99后，用剪刀剪下含有質(zhì)粒的濾紙部分，放入一個(gè)1.5 mL Eppendorf管中，然后加入50 μL滅菌去離子水至此管中，充分溶解后，12000 r/min，離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一個(gè) Eppendorf管，-20℃保存。

2.2.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取1.5 μL上述質(zhì)粒加入到50 μLTop10感受態(tài)細(xì)菌中;放入冰中30 min;42℃ 熱休克90 s;快速的將Eppendorf管移到冰中，冷卻1～2 min;加入1 mL新鮮 LB培養(yǎng)液，37℃，搖床 ＜50 r/min，振蕩 45 min，主要使 Amp基因表達(dá);4000 r/min，離心5 min，超凈臺(tái)中將 Eppendorf管中的上清液吸去一部分，并反復(fù)吹打，使感受態(tài)細(xì)胞懸浮;將懸浮液用涂布棒均勻的涂布到含50 μg/mL Amp的1.5%的瓊脂板上。平板倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜(12～16 h);以無(wú)菌牙簽挑取含氨芐青霉素瓊脂平板上的單菌落，接種到5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃，220 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜;取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)液加入 1.5 mL Eppendorf管中，10000 r/min離心2 min，棄0.3 mL上清液，并加入0.3 mL甘油到此含有細(xì)菌的離心管中，混勻后放入-70℃冰箱中保存。

2.2.1.3 質(zhì)粒抽提：將含質(zhì)粒eGFP-2A-CBGr99的甘油菌以1∶1000接種到5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒進(jìn)行小量抽提質(zhì)粒，具體方法如下：取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)物加入到1.5 mL Eppendorf管中，12000 r/min離心2 min;棄掉上清液后，加入100 μL Solution I，反復(fù)吹打至菌體充分懸浮，室溫下靜置1 min;加入 200 μL Solution II，輕輕顛倒 5次，室溫下靜置 1 min;加入 350 μL Solution III，輕輕顛倒5次，室溫下靜置1 min;12000 r/min離心5 min;轉(zhuǎn)移上清液至層析柱中，10000 r/min離心2 min;棄掉收集液，加入 500 μL Wash Solution，10000 r/min離心2 min;棄掉收集液，再加入500 μL Wash Solution，10000 r/min 離心 2 min;棄掉收集液，10000 r/min離心1 min;棄掉殘留的收集液，轉(zhuǎn)移層析柱到另一個(gè) 1.5 mL Eppendorf中，加入 50 μL Elution Buffer至層析柱中央?yún)^(qū)域，室溫孵育2 min，10000 r/min離心2 min，保留收集液，分別取出一部分質(zhì)粒溶液進(jìn)行后續(xù)分析(包括電泳、濃度及純度、酶切鑒定等)，剩下的質(zhì)粒溶液-20℃保存。

2.2.1.4 質(zhì)粒濃度測(cè)定及酶切電泳分析：取5 μL抽提的質(zhì)粒進(jìn)行1%agarose膠電泳，檢測(cè)質(zhì)粒大小，應(yīng)為5929 bp;取2 μL抽提的質(zhì)粒加入到78 μL去離子水中，1∶20稀釋后應(yīng)用核酸定量?jī)x測(cè)定其A260及A280，以檢測(cè)質(zhì)粒濃度及純度;用兩種內(nèi)切酶HindⅢ 及 XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，若為正確的克隆，則可被切出一個(gè)2731 bp及一個(gè)3198 bp片段。

2.2.2 慢病毒載體構(gòu)建

2.2.2.1 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99質(zhì)粒的構(gòu)建：將質(zhì)粒eGFP-2A-CBGr99與pWPXL載體質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切，37℃酶切3 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的DNA片段和酶切后的pWPXL載體片段;將回收的目的 DNA片段和pWPXL載體片段，用T4連接酶進(jìn)行連接，16℃水浴過(guò)夜;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。離心收集細(xì)菌并抽提重組質(zhì)粒。所提取的質(zhì)粒用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切鑒定;將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并制備少量質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序。測(cè)序正確后，命名為pWPXL-eGFP-2A-CBGr99;大量提取質(zhì)粒 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99。同時(shí)大量提取質(zhì)粒 pA2和pMDG2，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染細(xì)胞之用;

2.2.2.2 慢病毒載體的包裝：應(yīng)用 Lipofectamine 2000介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將三個(gè)質(zhì)粒(重組質(zhì)粒pWPXL-eGFP-2A-CBGr99，包裝質(zhì)粒 pA2和包膜質(zhì)粒pMDG2)共同轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。第 1天：接種2.5×106293T細(xì)胞至1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中;第2天：轉(zhuǎn)染前半小時(shí)，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換成無(wú)血清無(wú)抗生素 DMEM。將 12 μg重組質(zhì)粒載體 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99，9 μg 包裝質(zhì)粒 pA2 及 3.6 μg 包膜質(zhì)粒 pMDG2加入 DMEM至 1.5 mL，混勻;將60 μL Lipofectamine 2000 加入 DMEM 至 1.5 mL，混勻;靜置5 min后，將兩者混勻，室溫放置 20～25 min，滴加入培養(yǎng)皿中。6～8 h后，更換培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基9 mL，繼續(xù)培養(yǎng);第3天：熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;第4天：收集培養(yǎng)基，3000 r/min室溫離心5 min，0.45 μm濾膜抽濾。病毒可直接用于感染或-70℃保存。

2.2.2.3 慢病毒滴度測(cè)定(用293T細(xì)胞測(cè)定)：第1天：2.0×105293T細(xì)胞鋪在6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);第2天：換液，每孔加入新鮮完全培養(yǎng)基。消化其中一個(gè)孔中的細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。其余各孔每孔均加入多聚賴氨酸(Sigma)，使其終濃度為6 μg/mL。30 min后，加入病毒(病毒量按梯度加入，如 10 μL，50 μL，100 μL，200 μL 四個(gè)梯度);第3天：用完全培養(yǎng)基換液;第4天：熒光鏡下觀察表達(dá) GFP細(xì)胞。消化細(xì)胞，加入2 mL PBS，1000 r/min離心5 min;用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，把細(xì)胞置于冰上或冰箱中準(zhǔn)備分析。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP+細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)下列公式計(jì)算病毒滴度：滴度 =［%GFP+Cells］［day 2 cell count(cells/mL)］/volume of virus added(mL)

2.2.3 慢病毒感染

2.2.3.1 鋪板：消化細(xì)胞：將1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿細(xì)胞胰酶消化后，轉(zhuǎn)移一部分細(xì)胞懸液至1個(gè)5 mL離心管中，1500 r/min，離心 4 min，去除上清液，并用1 mL完全培養(yǎng)液重懸;計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度：分別取50 μL上述準(zhǔn)備的細(xì)胞懸液加入到450 μL無(wú)血清培養(yǎng)液中，10倍稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度;上述準(zhǔn)備的細(xì)胞懸液加入到1塊6孔板中的1個(gè)孔中，并用完全培養(yǎng)液補(bǔ)足體積至0.6 mL，混勻后，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2.3.2 慢病毒感染：第2天：昨日鋪板的1塊6孔板，棄掉各孔中舊培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基，各孔中再加入多聚賴氨酸(終濃度為6 μg/mL)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。30 min后，6.0×106單位病毒加入到各個(gè)孔中;第3天，棄掉各孔中的含病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng);第4天，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的各孔中細(xì)胞表達(dá)GFP情況。

2.2.4 流式細(xì)胞分選穩(wěn)定表達(dá)GFP細(xì)胞

2.2.4.1 消化細(xì)胞：上述經(jīng)過(guò)慢病毒感染后的細(xì)胞1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，經(jīng)胰酶消化，1%FBS DMEM吹打分散后，全部轉(zhuǎn)移至1個(gè)5 mL離心管中，1500 r/min，離心4 min，去除上清液，并用2%FBS DMEM培養(yǎng)液重懸，并轉(zhuǎn)移至流式分選樣品管中，4℃放置，備用。準(zhǔn)備2個(gè)15 mL離心管，分別加入7 mL 10%FBS DMEM，準(zhǔn)備收集細(xì)胞之用。

2.2.4.2 細(xì)胞分選：應(yīng)用流式細(xì)胞儀的分選模式分選并收集GFP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞;

2.2.4.3 細(xì)胞擴(kuò)增：分選結(jié)束后，將上述15 mL離心管，2000 r/min，離心4 min;棄掉上清液后，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸，分別轉(zhuǎn)移至1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

3 小動(dòng)物活體成像

3.1 制作動(dòng)物模型

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過(guò)尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標(biāo)記的細(xì)胞或組織。在建模時(shí)應(yīng)認(rèn)真考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮瓦x擇熒光標(biāo)記，如標(biāo)記熒光波長(zhǎng)短，則穿透效率不高，建模時(shí)不宜接種深部臟器和觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)移，但可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的觀察大多選用熒光素酶標(biāo)記［7］。

3.2 活體成像

小鼠經(jīng)過(guò)常規(guī)麻醉(氣麻、針麻皆可)后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開(kāi)啟照明燈(明場(chǎng))拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈，在沒(méi)有外界光源的條件下(暗場(chǎng))拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的特異光子。明場(chǎng)與暗場(chǎng)的背景圖疊加后可以直觀的顯示動(dòng)物體內(nèi)特異光子的部位和強(qiáng)度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。

3.3 數(shù)據(jù)處理

小動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強(qiáng)度標(biāo)尺的成像圖片外，還能計(jì)算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強(qiáng)度的相關(guān)參數(shù)供實(shí)驗(yàn)者參考。

3.4 實(shí)驗(yàn)影響因素

原則上，如預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)拍攝出圖片非特異性雜點(diǎn)多，需降低曝光時(shí)間;反之，如信號(hào)過(guò)弱可適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。但曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅增加了目的信號(hào)，對(duì)于背景噪音也存在一個(gè)放大效應(yīng)。同一批實(shí)驗(yàn)應(yīng)保持一致的曝光時(shí)間，同時(shí)還應(yīng)保持標(biāo)本相對(duì)位置和形態(tài)的一致，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。

進(jìn)行熒光成像時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選擇背景熒光低不容易反光的黑紙放在動(dòng)物標(biāo)本身下，減少金屬載物臺(tái)的反射干擾。動(dòng)物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會(huì)發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度。背景熒光主要是來(lái)源于皮毛和血液的自發(fā)熒光，皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自發(fā)熒光源，其發(fā)光光線波長(zhǎng)峰值在500～520 nm左右，在利用綠色熒光作為成像對(duì)象時(shí)，影響最為嚴(yán)重，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度和特異性。動(dòng)物尿液或其他雜質(zhì)如沒(méi)有及時(shí)清除，成像中也會(huì)出現(xiàn)非特異性信號(hào)。

由于各廠商的圖像分析軟件不同，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法也有區(qū)別?；铙w成像系統(tǒng)使用時(shí)，實(shí)驗(yàn)者考慮到非特異性雜信號(hào)，以及成像圖片美觀等方面，可能會(huì)調(diào)節(jié)信號(hào)的閾值，因此在分析信號(hào)光子數(shù)或信號(hào)面積時(shí)，應(yīng)考慮閾值的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。正確選擇ROI區(qū)域，可提高分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

4 展望

小動(dòng)物活體成像技術(shù)具有靈敏度高、直觀、操作簡(jiǎn)單、能同時(shí)觀測(cè)多個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，相比 PET、SPECT無(wú)放射損害等優(yōu)點(diǎn)，但也有其自身的缺陷，例如動(dòng)物組織對(duì)光子吸收、空間分辨率較低等問(wèn)題，因而仍需不斷地完善和改進(jìn)。小動(dòng)物活體成像按成像性質(zhì)屬于功能成像，如何能更好地與結(jié)構(gòu)成像技術(shù)(microCT、超聲等)相結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不但能夠定量，而且還能精確定位，這是活體成像技術(shù)今后的發(fā)展方向之一［8］。

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In Vivo Imaging Technology in Small Animal

ZHU Miao-xin，YAO Ming
(Department of Experimental Pathology，Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China)

Small animal in vivo imaging technology at home and abroad is more and more popular，which greatly promoted the life sciences，especially cancer research.This article describes the in vivo small animal imaging principles，methods and practical applications.

Fluorescent protein;Luciferase;In vivo imaging;Model，Animal

R-33 R332

B

1671-7856(2011)03-0001-05

2010-05-10

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.001

本文由高誠(chéng)教授推薦。