許旭旭，毛 政，吳 斌，孫洪林，何冰芳

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2浙江省食品藥物監(jiān)督管理局培訓(xùn)中心，浙江 杭州 310012）

研究開發(fā)

高速逆流色譜法分離純化內(nèi)嗎啡肽-1

許旭旭1，毛 政2，吳 斌1，孫洪林1，何冰芳1

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2浙江省食品藥物監(jiān)督管理局培訓(xùn)中心，浙江 杭州 310012）

利用高速逆流色譜技術(shù)對化學(xué)酶法合成的內(nèi)嗎啡肽-1粗樣進(jìn)行分離。分析了內(nèi)嗎啡肽-1粗樣雜質(zhì)的分配系數(shù)，選擇乙酸乙酯-甲醇-水（3∶1.5∶3，體積比）作為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，在主機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm條件下分離制備。從120 mg粗樣中分離得到71 mg樣品，內(nèi)嗎啡肽-1的純度達(dá)99.1%，樣品回收率為91.5%。該方法簡便、快速，為高純度內(nèi)嗎啡肽-1少量制法提供了技術(shù)，并可為高速逆流分離小肽合成產(chǎn)物提供指導(dǎo)。

高速逆流色譜；分離純化；內(nèi)嗎啡肽-1

內(nèi)嗎啡肽-1（EM-1：Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，結(jié)構(gòu)式見圖1）是1997年由美國杜蘭大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家James Zadina從牛腦和人腦中分離得到的四肽[1]。內(nèi)嗎啡肽-1在神經(jīng)系統(tǒng)中作用于μ-阿片受體，具有嗎啡類物質(zhì)的鎮(zhèn)痛作用，而嗎啡樣的生理依賴性、呼吸抑制及嚴(yán)重的腸胃反應(yīng)等副作用低，具有很好的研發(fā)前景[2]。目前內(nèi)嗎啡肽-1可以由化學(xué)[3]或化學(xué)酶法[4]合成，其合成產(chǎn)物的分離純化多采用傳統(tǒng)的硅膠色譜法，這種方法不僅費(fèi)時費(fèi)力、樣品損耗大，而且分離得到的產(chǎn)物純度也較低[5]。例如內(nèi)嗎啡肽-1化學(xué)合成后的分離純度一般為90%[5]，小肽也有通過制備型HPLC進(jìn)行分離的，但每次處理量較小，而溶劑消耗較大[6]。未見有采用高速逆流色譜法分離純化小肽合成產(chǎn)物的報道。

高速逆流色譜法（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的方法[7]。該技術(shù)可以用于短時間內(nèi)復(fù)雜樣品的有效分離，完全消除了因固體載體帶來的樣品不可逆的吸附和對樣品沾染等影響。目前HSCCC大多應(yīng)用于中草藥有效成分[8-9]、抗生素[10]、蛋白質(zhì)[11]等天然產(chǎn)物的分離與純化，在小肽的分離提純上報道很少。本研究首次利用高速逆流色譜法分離純化合成樣品中的內(nèi)嗎啡肽，在分析小肽化學(xué)酶法合成產(chǎn)物復(fù)雜組分的基礎(chǔ)上，選擇并優(yōu)化了高速逆流色譜分離小肽化合物的工藝，一步高回收率地得到純度為99.1%的內(nèi)嗎啡肽-1。

圖1 內(nèi)嗎啡肽-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速逆流色譜：TBE-300B 型高速逆流色譜儀（管徑2.6 mm，柱體積300 mL，進(jìn)樣圈體積20 mL，上海同田生物技術(shù)有限公司），包括TBP-5002型恒流泵，N2000雙通道色譜工作站；HD-4型紫外檢測器（南京大學(xué)普陽科學(xué)儀器研究所）；HX-1050型恒溫循環(huán)器（北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司）；P680型高效液相色譜儀（美國戴安公司），分析柱為Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，Kromasil，瑞典）；Water Q-TOF MicroTM質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣（上海吉爾生化公司），色譜純甲醇（江蘇漢邦有限公司），分析純乙酸乙酯（上海申博化工有限公司，分析純氯仿（上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司），分析純正丁醇（上海申博化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 化學(xué)酶法合成內(nèi)嗎啡肽-1

內(nèi)嗎啡肽-1酶法合成簡要步驟[12]：首先采用混合酸酐法由 Boc-Tyr和 Pro-OMe合成二肽Boc-Tyr-Pro-OH；其次，在20%甲醇反應(yīng)體系中利用耐有機(jī)溶劑蛋白酶 WQ9-2催化 Boc-Trp和Phe-NH2合成二肽Boc-Trp-Phe-NH2，產(chǎn)物以晶體的形式直接從反應(yīng)體系中析出；用50%（體積比，下同）三氟乙酸去除Boc保護(hù)基團(tuán)，得到Trp-Phe-NH2；最后采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶 PT121在水-乙酸乙酯（1∶3）雙相體系中催化 Boc-Tyr-Pro-OH 和Trp-Phe-NH2縮合制備Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2；用同樣的方法去除 Boc保護(hù)基后得到內(nèi)嗎啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）混合酶，為含 64.1%內(nèi)嗎啡肽-1的粗品。

1.2.2 溶劑體系的選擇

按溶劑體系配制一定體積的上相、下相溶劑，各取相同體積的上相、下相溶劑放置于同一容器中，加入一定量的樣品，劇烈振搖后靜置，待上相與下相分層后，取相同體積的上相和下相樣品液，然后用液相色譜以測定目標(biāo)成分在上相和下相中的濃度Cu、Cl，用來計算分配系數(shù)K（K=Cu/Cl）。

1.2.3 分離方法

在分液漏斗中配制經(jīng)過篩選的最佳溶劑，混合后靜置過夜，取上相作為高速逆流色譜的固定相，取下相作為流動相，超聲波脫氣30 min處理后，用20 mL固定相溶解120 mg樣品。高速逆流色譜體系開機(jī)預(yù)熱后，先將固定相以10 mL/min 的恒定速度泵滿螺旋管柱（200 mL），緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速至900 r/min順時針旋轉(zhuǎn)，同時以2.0 mL/min 泵入流動相，待流動相開始流出分離柱時，從進(jìn)樣口進(jìn)樣，流速改為1.0 mL/min，同時開啟檢測器，以280 nm 波長進(jìn)行檢測，根據(jù)色譜圖收集流出液體。

1.2.4 純度分析和質(zhì)譜檢測

使用HPLC對制備得到的樣品進(jìn)行純度分析，根據(jù)何平等[4]報道的方法略作調(diào)整，所用色譜柱為上述Kromasil 100-5 C18柱，柱溫為30 ℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。流動相為甲醇和水，梯度洗脫程序：0～5 min，20%甲醇；5～30 min，20%～100% 甲醇；30～40 min，100% 甲醇；流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜儀在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，離子源參數(shù) ESI：毛細(xì)管電壓2500 V，樣品錐電壓30 V，脫溶劑室溫度100 ℃，離子源溫度200 ℃，霧化氣（N2）體積流量50 L/h，脫溶劑氣（N2）體積流量400 L/h。

樣品的核磁檢測由中國藥科大學(xué)完成。

2 結(jié)果和討論

2.1 HSCCC分離體系的選擇

溶劑體系的選擇對分離效果起著決定性作用，不同的溶劑系統(tǒng)具有黏度、極性、密度等性質(zhì)的差異，均會對相同的成分產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，形成分配系數(shù)的差異，合適的體系應(yīng)該具有比較理想的分配系數(shù)，K值在0.5～2.0之間最佳，不同樣品的分配系數(shù)差值大于0.5可以得到有效分離[13]。本研究首先分析樣品中的主要成分，經(jīng)過二肽酶法縮合并去除Boc保護(hù)的樣品經(jīng)過HPLC檢測，共有7個峰[見圖3（b）]，其中峰2是極性相近的底物——二肽Trp-Phe-NH2，峰3是目標(biāo)化合物內(nèi)嗎啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2），峰 5為另一底物Boc-Tyr-Pro-OH，峰 6為脫保護(hù)前的內(nèi)嗎啡肽-1（Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2），峰1、峰4、峰7是酸解過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。本研究選擇了幾種不同極性的體系并在較好體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行了微調(diào)，通過考察不同體系的分配系數(shù)K值，來選擇合適的溶劑體系。由表1可知，在溶劑氯仿∶甲醇∶水（4∶3∶2，體積比，下同）中雜質(zhì)1、2與3的K值相近，不能很好的分離；在溶劑正丁醇∶乙酸乙酯∶水（體積比5∶1∶6）中雜質(zhì)4、5、6分配系數(shù)比較大，會導(dǎo)致較長的分離時間和較寬的峰形，不適合內(nèi)嗎啡肽-1的分離純化；在溶劑乙酸乙酯/甲醇/水體系中隨著甲醇比例的適當(dāng)增加，內(nèi)嗎啡肽-1（3）的分配系數(shù)達(dá)到了合適的范圍，同時與雜質(zhì)的K值差異也較大，保證與雜質(zhì)有較好的分離度。在乙酸乙酯∶甲醇∶水（體積比 3∶1.5∶3，）體系中不僅目標(biāo)產(chǎn)物內(nèi)嗎啡肽-1有合適的分配系數(shù)0.7，且與其它組分1、2、4、5、6、7的K值差異大于0.5，故將其選擇為分離小肽合成粗品中的內(nèi)嗎啡肽-1的溶劑體系。

表1 不同溶劑體系下粗樣的分配系數(shù)

2.2 內(nèi)嗎啡肽-1的HSCCC分離結(jié)果

利用選擇的溶劑體系，按照 1.2.3節(jié)的方法對內(nèi)嗎啡肽-1粗樣進(jìn)行HSCCC分離，固定相保留率45.0%，分離時間為2.5 h，根據(jù)圖譜（見圖2）收集餾分A（內(nèi)嗎啡肽-1）。陰影部分為餾分收集區(qū)間，對組分A進(jìn)行減壓濃縮，得到白色粉末71 mg（進(jìn)樣量為120 mg，粗品純度64.1%），收率為91.5%。

圖2 內(nèi)嗎啡肽-1合成粗樣品的HSCCC 色譜圖

2.3 產(chǎn)物的純度檢測和鑒定

將收集到的A峰與內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣進(jìn)行HPLC檢測，從HPLC 色譜圖中可以看出，在280 nm波長條件下，餾分A 僅有一個色譜峰出現(xiàn)且保留時間與內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣相同（見圖3），同時采用HPLC峰面積歸一化法，計算分離得到的餾分A 的純度為99.1%，回收率為91.5%，與傳統(tǒng)的小肽分離方法相比效果顯著。如Giuliana等[14]采用硅膠柱分離內(nèi)嗎啡肽-1的類似物，回收率只有 60%～90%，Wang等[15]采用硅膠柱層析法分離內(nèi)嗎啡肽-2的類似物回收率為40%～90%。

圖3 內(nèi)嗎啡肽-1的HPLC色譜圖

對餾分 A作高分辨質(zhì)譜檢測，HRMS：m/z611.2994. Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2（C34H39N6O5）[M+H]+的理論計算值為611.2982，在儀器誤差范圍內(nèi)與內(nèi)嗎啡肽-1的相對分子質(zhì)量一致；對分離所得的內(nèi)嗎啡肽-1進(jìn)行核磁分析（核磁共振結(jié)果由中國藥科大學(xué)提供）：1HNMR（DMSO，500 MHz）：δ10.79（trans）和 10.74（cis）（s，s，1H，W1NH），9.43（cis）和9.35（trans）（s，s，1H，YOH），8.22（d，8.3，1H，WNH），8.03，7.85（dd，8.1，2H，YNH2），7.99（d，7.5，1H，F(xiàn)NH），7.59～7.56（m，trans+cis，1H，W2ar），6.90～7.33（m，14H，aromatic），6.70～6.67（m，trans+cis，2H，Y3，5），4.39～4.51（m，3H，PαWαFα），4.18（t，6.0，1H，Yα），2.77～3.09（m，8H，Yβ1Yβ2Fβ1Fβ2Wβ1Wβ2Pδ1Pδ2），1.50～1.96（m，4H，Pβ1Pβ1Pg1Pg2）。13C NMR（DMSO，500M Hz，trans+cis）δ172.6、172.5、170.9、170.8、170.7、170.3、167.0、156.7、156.5、137.7、136.0、130.7、130.3、129.2、127.9、127.3、127.2、126.2、124.6、124.0、123.6、123.2、120.9、120.8、118.2、115.3、111.4、111.2、109.9、109.7、59.6、59.1、53.6、52.5、46.7、37.4、36.3、35.3、31.1、28.8、27.5、27.4、24.4。綜合 HPLC，質(zhì)譜及核磁共振譜的檢測結(jié)果可確定餾分A 為內(nèi)嗎啡肽-1。

3 結(jié) 論

采用高速逆流色譜首次分離了化學(xué)酶法合成二肽混合物，利用乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為3∶1.5∶3）溶劑體系從120 mg（粗樣含量64.1%）的合成粗樣中一步分離得到71 mg純度為99.1%的內(nèi)嗎啡肽-1，回收率為 91.5%。方法簡捷、快速、回收率高，為分離制備高純度的內(nèi)嗎啡肽-1提供了實(shí)用的手段，同時也為化學(xué)法或化學(xué)酶法合成肽類產(chǎn)品的高效分離純化提供指導(dǎo)。

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Preparative isolation and purification of endormophin-1 by high-speed counter-current chromatography

XU Xuxu1，MAO Zheng2，WU Bin1，SUN Honglin1，HE Bingfang1
（1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China；2Zhejiang Food and Drug Administration Training Center，
Hangzhou 310012，Zhejiang，China）

Endormophin-1 synthesized by chem-biological method was purified by high-speed counter-current chromatograph technology（HSCCC）. The optimum separation conditions were as follows：A two-phase solvent system was ethyl acetate-methanol-water（3∶1.5∶3，v/v/v）. The lower phase as the mobile phase was operated at a flow rate of 1.0 mL /min，while the apparatus was rotated at 900 r/min，and detection were length was at 280 nm. Each time 120 mg of the crude sample was loaded under these conditions，and 71 mg of endorphin-1 with the purity of 99.1% was obtained. The recovery was 91.5%. The method was relatively simple，fast，and applicable to the large-scale isolation and separation of endormophin-1.

high-speed counter-current chromatography（HSCCC）；preparative isolation and purification ；endormophin-1

TQ 028.9+8

A

1000-6613（2011）09-2064-05

2011-03-03；修改稿日期2011-04-27。

國家973計劃項目（2011CB710800）。

許旭旭（1985—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：何冰芳，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物、酶工程方面的研究。E-mail bingfanghe@njut.edu.cn。