賴心田 張世偉 藍(lán)迪曦 陳薇 楊國(guó)武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 廣東深圳 518131)

發(fā)酵酒中T-2毒素污染調(diào)查分析及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

賴心田 張世偉 藍(lán)迪曦 陳薇 楊國(guó)武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 廣東深圳 518131)

本研究建立了啤酒、葡萄酒中T-2毒素免疫學(xué)檢測(cè)的前處理方法。該方法采用氯仿提取,檢出限為0.2ng/mL,回收率為89.7%-101.3%。并首次對(duì)市場(chǎng)上啤酒和葡萄酒的T-2毒素污染水平進(jìn)行了調(diào)查。在對(duì)深圳市民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查的基礎(chǔ)上,對(duì)啤酒和葡萄酒的T-2毒素污染進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,結(jié)果顯示這兩種產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)較低。

T-2毒素;啤酒;葡萄酒;風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1 前言

T-2毒素是鐮刀菌所產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種,其主要產(chǎn)毒菌為擬技孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)。T-2毒素具有明顯的細(xì)胞毒性,對(duì)蛋白質(zhì)、DNA的合成有抑制作用。T-2毒素主要污染小麥、大麥、黑麥、玉米等谷物及制品,對(duì)人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了極大危害。目前,主要對(duì)大麥、玉米、小麥、稻米、高粱等農(nóng)作物進(jìn)行T-2毒素的監(jiān)測(cè)。我國(guó)對(duì)T-2毒素的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,面粉、玉米粉中污染比較嚴(yán)重,大米情況較好[1,2]。

啤酒素有“液體面包”的美稱,營(yíng)養(yǎng)豐富、老少皆宜;葡萄酒更因具有軟化血管、保護(hù)心臟、抗癌、調(diào)節(jié)血壓、美容養(yǎng)顏等功效倍受大眾喜愛(ài);發(fā)酵酒是農(nóng)作物的下游加工制品,如果原料中含有T-2毒素,則T-2毒素極有可能帶入酒中。然而,對(duì)啤酒、葡萄酒等發(fā)酵酒產(chǎn)品,還沒(méi)有見(jiàn)到T-2毒素殘留調(diào)查的報(bào)道。免疫學(xué)檢測(cè)因其快速、靈敏、簡(jiǎn)便、高通量被大量應(yīng)用于真菌毒素的監(jiān)控。本研究對(duì)發(fā)酵酒中T-2毒素免疫學(xué)檢測(cè)的提取方法進(jìn)行了摸索,并用建立的方法調(diào)查了市場(chǎng)上啤酒、葡萄酒中T-2毒素的含量,在對(duì)深圳市民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查的基礎(chǔ)上,對(duì)發(fā)酵酒中T-2毒素進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

2 材料與方法

2.1 試劑與樣品

T-2毒素免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒為Romer公司產(chǎn)品;T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品;葡萄酒19份,啤酒27份,從深圳市場(chǎng)購(gòu)買。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

量取5.0mL樣品加入125mL分液漏斗中,加入20mL氯仿混合,加塞振搖5min,靜置分層,收集下層氯仿溶液于100mL的蒸發(fā)皿中。再在加入20.0 mL氯仿于分液漏斗中,重復(fù)振搖萃取2次,將氯仿萃取液并入同一個(gè)蒸發(fā)皿中,65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后,加入1.0mL70%甲醇溶解備用。

2.2.2 方法驗(yàn)證

將T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(100μg/mL)用70%甲醇水稀釋至所需濃度。為測(cè)試試劑盒的線性范圍與檢出限,配制0、0.125、0.250、0.500、1.00、3.75、7.50、15.0、30.0、60.0、100、500、1000ng/mL系列濃度的T-2毒素溶液,用酶標(biāo)法測(cè)定每孔的光密度值(波長(zhǎng)450nm)。通過(guò)陰性啤酒、葡萄酒樣品不加標(biāo)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提取方法的可靠性和穩(wěn)定性,加標(biāo)濃度為1ng/mL、50ng/mL和200 ng/mL。

2.2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

向深圳市民隨機(jī)發(fā)放問(wèn)卷,對(duì)調(diào)查問(wèn)卷回收后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 方法驗(yàn)證

通過(guò)相關(guān)性分析,方法的線性范圍為1-1000 ng/mL(R2=0.9974),檢出限為0.2ng/mL。分別對(duì)5個(gè)UPLC-MS/MS法[3]證明為陰性的葡萄酒和啤酒樣品進(jìn)行檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,葡萄酒和啤酒樣品中T-2毒素的添加回收率分別為100.0%、93.8%。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠,能滿足調(diào)查的要求。

表1 檢測(cè)方法的添加回收率

3.2 樣品測(cè)試

從19份葡萄酒中檢出11份,檢出率為57.9%,污染程度在0-1.67ng/mL(見(jiàn)表2),平均0.4152ng/mL;從27份啤酒中檢出9份,檢出率為33.3%,污染程度在0-0.67ng/mL(見(jiàn)表3),平均0.4152ng/mL。

表2 市場(chǎng)上葡萄酒中T-2毒素污染水平調(diào)查結(jié)果

表3 市場(chǎng)上啤酒中T-2毒素污染水平調(diào)查結(jié)果

3.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3.3.1 深圳居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查

深圳是個(gè)新興城市,人口結(jié)構(gòu)復(fù)雜,居民來(lái)自全國(guó)各地,其膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查分析數(shù)據(jù)可視為全國(guó)的一個(gè)縮影,對(duì)全國(guó)居民膳食結(jié)構(gòu)研究有一定參考價(jià)值。本調(diào)查選取了不同年齡階段、不同行業(yè)的各類人群作為調(diào)查對(duì)象,針對(duì)深圳市居民個(gè)人膳食結(jié)構(gòu)做出調(diào)查分析,為進(jìn)一步的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)提供有利證據(jù)。本次調(diào)查隨機(jī)向人群共發(fā)放106份調(diào)查表,實(shí)際收回52份,以下數(shù)據(jù)均以52人計(jì)算。被調(diào)查者年齡跨度為20-80歲,其中男女比例為1:1.3,其中20-30歲有22人,30-40歲有10人,40-50歲有12人,50歲以上8人,人群具有一定的代表性,年齡分布比較均勻,便于對(duì)整體膳食結(jié)構(gòu)全面分析。被調(diào)查的行業(yè)包括制造業(yè)、IT電子、檢驗(yàn)、新聞、化工、服務(wù)業(yè)、綠化、個(gè)體戶、金融保險(xiǎn)、學(xué)生、美術(shù)等,涵蓋了深圳各主要行業(yè)。

調(diào)查結(jié)果顯示,深圳市居民每人每周攝入葡萄酒范圍在0-1000mL(大多數(shù)在5-250mL)之間,每人每周攝入葡萄酒平均量為76mL,每人每天攝入量平均為10.9mL。深圳市居民每人每周攝入啤酒范圍在0-2500mL(大多數(shù)在0-250mL)之間,每人每周攝入啤酒平均量為322mL,每人每天攝入量平均為46.1mL。

3.3.2 深圳市民攝入T-2毒素人均日暴露水平

葡萄酒污染T-2毒素的平均水平為0.4152 ng/mL,人均每日消費(fèi)10.9mL,啤酒污染T-2毒素的平均水平為0.1759 ng/mL,人均每日消費(fèi)46.1 mL。據(jù)此計(jì)算,深圳居民每天從葡萄酒和啤酒中攝入T-2毒素的量分別為4.52ng和8.11ng。

3.3.3 風(fēng)險(xiǎn)描述

2001年JECFA第56次會(huì)議,將T-2毒素的PMTD I(暫定每日耐受最大攝入量)定為60ng/kg.bw。以成人60kg體重計(jì)算,每人每天攝入T-2毒素的安全閾值為3600ng。而對(duì)深圳居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示深圳居民每天從葡萄酒和啤酒中攝入T-2毒素的量分別為4.52ng和8.11ng,遠(yuǎn)低于安全閾值?？紤]到因個(gè)體、性別、年齡、職業(yè)的差異,飲酒量有所不同,某些人群飲酒量可能較大。但即便飲酒量超過(guò)平均值的100倍,攝入T-2毒素的量仍低于3600ng的安全閾值。因此,從目前的數(shù)據(jù)分析,食用葡萄酒和啤酒導(dǎo)致T-2毒素影響身體健康的風(fēng)險(xiǎn)較低。

目前,我國(guó)還沒(méi)有T-2毒素的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn),前蘇聯(lián)已提出國(guó)家的食品衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)為100ng/mL。從檢測(cè)結(jié)果看,市場(chǎng)上發(fā)酵酒中T-2毒素污染水平均遠(yuǎn)低于100ng/mL,在安全范圍內(nèi)。

4 討論

T-2毒素難溶于水,易溶于極性有機(jī)溶劑,溶于二氯甲烷和氯仿,微溶于石油醚,性質(zhì)穩(wěn)定,室溫下放置6-7h或加熱至200℃1-2h毒力仍無(wú)減弱,而堿性條件下次氯酸鈉可使其失去毒性。

目前,對(duì)T-2毒素的調(diào)查研究都主要集中在糧食和飼料等初級(jí)加工產(chǎn)品。GB/T5009.118-2008制定了谷物中T-2毒素的檢測(cè)方法,高效液相色譜法和免疫法的檢測(cè)限分別為10μg/kg和1μg/kg,但未見(jiàn)發(fā)酵酒的檢測(cè)方法。Romero等人采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法首次對(duì)發(fā)酵酒中T-2毒素進(jìn)行檢測(cè)[3]。其檢測(cè)限達(dá)到0.02ng/mL,但其提取過(guò)程較為復(fù)雜,不適合于大規(guī)模調(diào)查性試驗(yàn)。免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單,并且研究技術(shù)日趨成熟,被廣泛用于真菌毒素的市場(chǎng)調(diào)查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)[4-5]。真菌毒素的免疫學(xué)檢測(cè)方法的前處理過(guò)程一般分為兩種:直接提取法和萃取法。米面等糧食作物主要采用直接提取法。直接提取法一般使用甲醇、乙腈等極性較大的有機(jī)溶劑。曹艷紅等人用70%甲醇溶液提取大米、面粉等樣品中的T-2毒素,回收率可達(dá)到85%-117.5%[6]。若在發(fā)酵酒中直接加入甲醇水或乙腈溶液,甲醇水或乙腈溶液會(huì)與樣品互溶,因發(fā)發(fā)酵酒成分復(fù)雜,直接進(jìn)行EL ISA檢測(cè),結(jié)果會(huì)有干擾。因此對(duì)發(fā)酵酒這類基質(zhì)復(fù)雜的樣品,必須采用萃取法。本研究在提取T-2毒素時(shí),首先考慮用極性小的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。在葡萄酒T-2毒素的提取過(guò)程中曾使用乙酸乙酯及石油醚。乙酸乙酯結(jié)果提取液呈淺紅色,是葡萄酒中的紅色素溶于乙酸乙酯,造成樣品本底高,回收率也異常增加,基質(zhì)干擾明顯。由于T-2毒素微溶于石油醚,石油醚提取的回收率并不理想。本研究參照了Suga等人用乙酸乙酯-甲醇(95:5)的提出方法[7],同樣基質(zhì)干擾非常明顯,因而改用氯仿萃取。在用氯仿溶劑萃取時(shí),會(huì)不同程度的乳化現(xiàn)象發(fā)生,操作不當(dāng)會(huì)影響提取效率。為避免此現(xiàn)象,在加氯仿溶液前應(yīng)先除去啤酒中的CO2,并加大氯仿用量和萃取次數(shù)。有時(shí)在兩液相之間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀物,要避免混絮狀物進(jìn)入氯仿層中。

產(chǎn)生T-2毒素的鐮刀菌是在田間感染農(nóng)作物并產(chǎn)生毒素,因此加強(qiáng)作物的田間管理對(duì)預(yù)防真菌污染很有幫助。此外,對(duì)作物的收割采摘、貯藏、運(yùn)輸及加工過(guò)程實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化管理,也是防止T-2毒素污染糧食的有效手段。保證原料免受T-2毒素污染,才能最大程度保證發(fā)酵酒產(chǎn)品該方面的質(zhì)量。

[1] 孫殿軍,劉運(yùn)起,李群偉.黑龍江省大骨節(jié)病區(qū)非病區(qū)主食中T-2毒素檢測(cè)報(bào)告[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,1997,16(4):207-209.

[2] 馮杰,曹艷紅,王紹萍,等.黑龍江省市售糧食T-2毒素檢測(cè)與分析[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2004,23(6):560-561.

[3] Romero-González R,Frenich AG,Vidal JL,et al.Determination of ochratoxin A and T-2 toxin in alcoholic beverages by hollow fiber liquid phase micro extraction and ultra high-pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J].Talanta,2010,82:171-176.

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[5] 李磊,賴心田,張毅杰,等.用免疫學(xué)方法調(diào)查分析臘肉制品赭曲霉毒素A及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(8):1605-1606.

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Investigation and Analysis of T-2 Toxin in Brewed Wine and Its Risk Assessment

Lai Xintian,Zhang Shiwei,Lan Dixi,Chen Wei,Yang Guowu

(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection,Shenzhen,Guangdong,518131)

This research establishes the pre-treatment methods of immunological detection of T-2 toxin in beer and wine based on chloroform distillation.The limit of detection is 50ng/mL.The recovery rates were be tween 89.7%-101.3%.This is the first detection of T-2 toxin in beer and wine sold on the market.Based on the research of food structure of Shenzhen people,the risk assessment of T-2 toxin shows a low level in both beer and wine.

T-2 Toxin;Beer;Wine;Risk Assessment

F207.4