鄭振佳，初玉圣，遲炳海，王 曉,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3.山東龍大食品集團有限公司，山東 煙臺 265231)

快速分離液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析大豆中的異黃酮成分

鄭振佳1,2，初玉圣3，遲炳海3，王 曉1,2,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3.山東龍大食品集團有限公司，山東 煙臺 265231)

建立快速分離液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF)聯(lián)用技術分析大豆中的異黃酮的方法。大豆樣品經(jīng)甲醇超聲輔助提取后，選用Welch Materials C18柱，以乙腈-水(含0.1%甲酸)為流動相進行梯度洗脫。結(jié)果表明在正離子模式下，經(jīng)快速分離液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分離并檢測出9種異黃酮成分。RRLC-Q-TOF聯(lián)用技術可以快速準確鑒定樣品中的異黃酮成分。

快速分離液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF)；大豆；異黃酮

大豆異黃酮是大豆中的重要生理活性物質(zhì)，以大豆異黃酮為活性成分的保健食品和功能食品逐漸為人們所接受[1-2]。研究證明：大豆異黃酮有預防癌癥、防止骨質(zhì)疏松、防止心血管疾病、抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化以及防止酒精中毒等生理活性，日本已將大豆異黃酮添加于食品中做為食品營養(yǎng)劑來使用[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，分為游離型的苷元及其相應的糖苷[5]。大豆異黃酮的檢測方法多采用紫外分光光度法(UV)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-MS)等[6-9]，分析過程依賴對照品且靈敏度不高，快速鑒定效果不理想。

高分辨率飛行時間質(zhì)譜具有高分辨率，能夠不降低靈敏度而測定化合物的精確分子質(zhì)量[10-11]，對分子質(zhì)量數(shù)相差10-6的不同分子進行有效區(qū)分，與液相色譜聯(lián)用是分析植物活性成分的有效方式，在天然產(chǎn)物分析方面越來越受到重視[12-13]。

本實驗采用快速分離液相-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術，利用分子離子的精確質(zhì)量數(shù)，無需對照品，快速分析鑒定大豆中的異黃酮，旨在為快速評價大豆及其制品的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆(粉碎至60目) 千佛山農(nóng)貿(mào)市場；Welch Materials C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)美國Welch Materials公司。乙腈(色譜純)；甲醇(分析純)；實驗用水為去離子超純水。6520四極桿-飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.2 樣品制備

精密稱取大豆粉末1.0g，放入50mL具塞試管中，加入10mL甲醇，室溫超聲提取15min，取上清液，過0.22μm濾膜，作供試樣品。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Materials C18；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液，流動相梯度組成如表1所示；流速：1mL/min；進樣量：20μL；柱溫：30℃；檢測波長：260nm。

表1 線性梯度洗脫表Table 1 Linear gradient elution of tetracyclines

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源ESI，四極桿溫度100℃，霧化壓力50psi，碎裂電壓175V，干燥器溫度350℃，干燥氣流量10L，毛細管電壓4000V，正離子模式掃描，掃描范圍m/z100～1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 Q-TOF條件優(yōu)化

本實驗分別采用正、負兩種離子模式進行質(zhì)譜分析，優(yōu)化最佳分析條件以獲得最佳靈敏度。實驗表明，正離子模式比負離子模式更加靈敏，因此本實驗采用正離子模式進行檢測。同時發(fā)現(xiàn)流動相中加入適當甲酸更利于增強質(zhì)譜信號，從而提高靈敏度，考慮到酸性太強會對色譜柱有所損害，因此選擇在水中添加0.1%甲酸。

2.2 大豆中異黃酮成分的分析

圖1 大豆提取液的色相色譜圖(A)和總離子流圖(B)Fig.1 Rapid resolution liquid chromatogram (A) and total ion chromatogram (B) of soybean extract

圖2 異黃酮的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of soybean extract

經(jīng)四極桿-飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀分析，大豆提取物的液相色譜圖和總離子流圖見圖1。

本實驗所采用的高分辨率飛行時間質(zhì)譜能夠得到待測組分的分子離子峰及其精確相對分子質(zhì)量，根據(jù)得到化合物的精確相對分子質(zhì)量，參考相關文獻，對各化合物進行鑒別。根據(jù)圖2由文獻推斷大豆異黃酮的成分如下：

峰1(圖2a)獲得m/z417.22850[M+H]+質(zhì)譜信號，峰2(圖2b)獲得m/z447.12908[M+H]+質(zhì)譜信號，峰3(圖2c)獲得m/z433.11357[M+H]+質(zhì)譜信號，峰7(圖2g)獲得m/z271.06014[M+H]+質(zhì)譜信號，峰8(圖2h)獲得m/z255.06551[M+H]+質(zhì)譜信號，峰9(圖2i)獲得m/z285.07611[M+H]+質(zhì)譜信號，根據(jù)文獻[15]推斷其分別為大豆苷(C21H20O9)、黃豆黃苷(C22H22O10)、染料木苷(C21H20O10)、染料木素(C15H10O5)、大豆甙元(C15H10O4)和黃豆黃素(C16H12O5)。

峰4(圖2d)獲得m/z503.11949[M+H]+質(zhì)譜信號，峰5(圖2e)獲得m/z533.13013[M+H]+質(zhì)譜信號，峰6(圖2f)獲得m/z519.11411[M+H]+質(zhì)譜信號，根據(jù)文獻[14]推斷其分別為丙二?；蠖管?C24H22O12)、丙二?；S豆黃苷(C25H24O13)和丙二?；玖夏拒?C24H22O13)。

大豆中的異黃酮成分液相保留時間、質(zhì)譜分子離子峰、相對分子質(zhì)量實驗測定值和理論值如表2所示，通過比較可以看出相對分子質(zhì)量實驗測定值和理論值相差很小。

表2 大豆提取液中異黃酮的RRLC-Q-TOF分析Table 2 RRLC-Q-TOF analysis of isoflavonoids in soybean extract

3 結(jié) 論

本實驗采用快速分離液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術，利用分子離子的精確質(zhì)量數(shù)，無需對照品，快速分析鑒定大豆中的異黃酮，對大豆的質(zhì)量控制、提取物指紋圖譜的建立及不同大豆品質(zhì)差異的分析檢測具有重要意義。所建方法對植物中黃酮類物質(zhì)的分析檢測提供了新的參考依據(jù)，對天然產(chǎn)物有效成分的定性分析具有重要的意義。

[1] 李鵬, 李曉磊, 高長城. 大豆異黃酮生理功能的研究進展[J]. 長春大學學報, 2009, 19(10): 58-60.

[2] 黃文宇, 柳陳堅, 李海燕. 傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中大豆異黃酮的生理保健機能的研究進展[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2009, 21(10): 949-952.

[3] 張艷舫, 王晶, 傅博強. 保健食品中大豆異黃酮含量的高效液相色譜法測定[J]. 食品科技, 2008(8): 191-196.

[4] ZUBIK L, MEYDANI M. Bioavailability of soybean isoflavones from aglycone and glucoside foems in American women[J]. American J Clinical Nutrition, 2003, 77(6): 1459-1465.

[5] 金米聰, 龔文杰, 馬建明. 大豆及其制品中 12種大豆異黃酮的HPLC及HPLC-MS法測定研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(8): 900-903.

[6] 高榮海, 李長彪, 孟憲文, 等. 大豆異黃酮分離及其檢測方法的研究進展[J]. 中國調(diào)味品, 2006(7): 4-8.

[7] 胡曉娟, 蘇惠. 保健品原料中大豆異黃酮的HPLC法測定[J]. 光譜實驗室, 2007, 24(2): 268-270.

[8] MITANI K, NARIMATSU S, KATAOKA H. Determination of daidzein and genistein in soybean foods by automated on-line in-tube solid-phase microextraction coupled to high performance liquid chromatography[J].J Chromatography A, 2003, 986(2): 169-177.

[9] WU Qingli, WANG Mingfu, SIMON J E. Determination of isoflavones in red clover and related species by high-performance liquid chromatography combined with ultraviolet and mass spectrometric detection[J]. J Chromatogr A, 2003, 1016(2): 195-209.

[10] 李文龍, 陳軍輝, 殷月芬, 等. 加速溶劑提取-高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析蓮子心中生物堿[J]. 分析化學, 2008, 36(1): 79-82.

[11] 韓超, 陳軍輝, 劉劼, 等. 高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜分析太子參中環(huán)肽類化合物[J]. 分析化學, 2006, 34(12): 1719-1722.

[12] 葉茂, 謝國祥, 趙愛華, 等. 超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法測定苦參素注射液中苦參堿和氧化苦參堿[J]. 中國中藥雜志, 2008, 32(12): 1390-1401.

[13] 何忠梅, 孫佳明, 張輝, 等. 固相萃取-高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法分析芍藥和酒芍藥的水溶性化學成分[J]. 分析化學, 2009, 37(8): 1021-1025.

[14] DU Qizhen, LI Zhonghua, ITO Y. Preparative separation of isoflavone components in soybeans using high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A, 2001, 923(1/2): 271-274.

[15] YANG Fuquan, MA Ying, ITO Y. Separation and purification of isoflavones from acrude soybean extract by high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A, 2001, 928(2): 163-170.

Analysis of Isoflavonoids in Soybean by Rapid Resolution Liquid Chromatography-Quatrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

ZHENG Zhen-jia1,2，CHU Yu-sheng3，CHI Bing-hai3，WANG Xiao1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China；2. Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China；3. Shandong Longda Foodstuff Group Co. Ltd., Yantai 265231, China)

A novel method for the analysis of isoflavonoids in soybean was established by rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF-MS). Samples were extracted with methanol under ultrasound assistance, and then a Welch Materials C18 column was applied in the RRLC separation using acetonitrile and water (0.1% formic acid) as the mobile phase. Elutes were detected by Q-TOF to obtain MS spectra with a positive ion mode.Nine isoflavonoids were identified. Therefore, this method can be used to rapidly determine isoflavonoids of soybean.

RRLC-Q-TOF；soybean；isoflavonoids

O657.63

A

1002-6630(2011)06-0233-04

2010-04-29

國家自然科學基金項目(20872083)；山東省科技攻關項目(2009GG2001021-16)；

作物生物學國家重點實驗室開放課題(20082KF05)

鄭振佳(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化與活性。E-mail：pengyou-jia@163.com

*通信作者：王曉(1971—)，男，研究員，博士，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化與活性。E-mail：wangx@keylab.net