趙瑛博，周艷明,*，忻 雪,2，王巖松

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽市糧油檢測(cè)計(jì)量所，遼寧 沈陽 110021；3.沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧 沈陽 110022)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果、蔬菜中赤霉素殘留

趙瑛博1，周艷明1,*，忻 雪1,2，王巖松3

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽市糧油檢測(cè)計(jì)量所，遼寧 沈陽 110021；3.沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧 沈陽 110022)

建立一種快速、靈敏的檢測(cè)蔬菜水果中赤霉素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法。采用甲醇溶液作為提取劑，調(diào)節(jié)pH值后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后用C18固相萃取柱凈化，凈化后的溶液用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：該方法線性范圍為0.01～10.0μg/mL，檢測(cè)限為0.01μg/mL；在添加濃度0.02～1.0mg/kg范圍內(nèi)，赤霉素的平均回收率在77.0%～100.0%之間，變異系數(shù)在3.39%～10.05%之間(n=5)。該方法具有靈敏、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，能夠滿足限量檢測(cè)的要求。

赤霉素；殘留；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)

赤霉素是一種廣譜性植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育的各個(gè)階段都有重要的調(diào)節(jié)作用，廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜的增產(chǎn)、增效方面[1]，正因?yàn)槌嗝顾氐膹V泛使用，其在水果、蔬菜的生產(chǎn)中有被濫用的情況，而赤霉素的殘留對(duì)人類存在潛在危險(xiǎn)。目前我國(guó)對(duì)赤霉素的最高殘留限量未做出規(guī)定，美國(guó)、日本等國(guó)家規(guī)定其在水果、蔬菜中的最高殘留限量為0.2mg/kg[2]。為了對(duì)生產(chǎn)中赤霉素的使用情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，保證食品安全，有必要對(duì)赤霉素殘留量的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。目前赤霉素的檢測(cè)方法主要有熒光光譜法[3]、酶聯(lián)免疫法[4-5]、氣相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜[8]和液相色譜法[9-19]等。這些方法中有些前處理方法太過繁瑣，有些方法靈敏度較低，本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種前處理較為簡(jiǎn)便、靈敏度較高的測(cè)定赤霉素殘留的方法，以期為標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜、水果 市售。

甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；乙酸乙酯(分析純)、無水甲酸(分析純)、鹽酸(分析純) 沈陽化學(xué)試劑廠；赤霉素(GA3)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；API-4000串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源) 美國(guó)ABI公司；SPE-Pak C18固相萃取小柱 美國(guó)Waters公司；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器設(shè)備廠；T25勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 提取

稱取10g(精確至0.01g)樣品于100mL燒杯中，加入20mL甲醇-水(80:20，V/V)溶液，在10000r/min條件下均質(zhì)1min，布氏漏斗抽濾，濾液收集于雞心瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(水浴溫度45℃)濃縮至約5mL。

1.3.2 凈化

分析泄水閘閘室段基礎(chǔ)錨筋樁施工以及質(zhì)量控制措施……………………………………………………… 胡志堅(jiān)（4-45）

濃縮液用0.1mol/L鹽酸調(diào)pH3.0～4.0后，加入5mL乙酸乙酯振蕩1min，靜置分層。取上層有機(jī)相4mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘?jiān)?mL甲醇-水(5:95，V/V)溶液定容后，過SPE-Pak C18固相萃取小柱(使用前分別用1mL甲醇和1mL水活化)，用3mL甲醇-水(40:60，V/V)溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液蒸至近干后用甲醇定容至1mL，過0.22μm的濾膜，待測(cè)。

1.4 色譜條件

表1 流動(dòng)相梯度組成和流速Table 1 Compositions and flow rate of mobile phase

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(2.1mm×100mm，3.5μm)；流動(dòng)相：A為甲醇；B為甲酸-水溶液(0.2:99.8，V/V)，流動(dòng)相梯度組成和流速如表1所示；柱溫35℃；進(jìn)樣量：2 0μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源(ESI)；掃描方式為負(fù)離子掃描模式；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣流速70L/min；干燥氣流速60L/min；干燥氣溫度600℃；噴霧電壓為－4500V。母離子、子離子、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見表2。

表2 赤霉素的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters of gibberellin

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

對(duì)于蔬菜水果等含水量多的樣品，應(yīng)選用與水互溶的溶劑作為提取劑。實(shí)驗(yàn)中分別使用甲醇-水(60:40，V/V)溶液1、甲醇-水(80:20，V/V)溶液2以及純甲醇作提取溶劑，比較其對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，甲醇-水溶液1提取效果較差(回收率56.73%)，不宜采用；甲醇-水溶液2和純甲醇提取植物組織中的赤霉素，回收率(分別為86.4%和89.5%)均能達(dá)到要求，但使用純甲醇提取時(shí)，在接下來的液液萃取時(shí)容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，所以采用甲醇-水溶液2作為提取劑。

2.2 pH值的選擇

赤霉素為一種弱酸，其pKa=3.8，在酸性溶液中赤霉素處于分子狀態(tài)，用乙酸乙酯萃取時(shí)，分子狀態(tài)的赤霉素易于分配在有機(jī)相中。研究提取液pH值和赤霉素回收率的關(guān)系，結(jié)果表明，當(dāng)pH3.0～4.0時(shí)，赤霉素的回收率最高(92%)。

2.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度的選擇

赤霉素在高溫條件下容易分解，所以在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)不能采用太高的溫度，但是溫度也不能太低，否則乙酸乙酯蒸發(fā)的速度慢，赤霉素長(zhǎng)時(shí)間受熱也會(huì)造成一定的損失。分別考察蒸發(fā)溫度在40、45、50、60℃條件下的赤霉素回收率，發(fā)現(xiàn)蒸發(fā)溫度大于50℃后，回收率有明顯損失，所以選擇的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為45℃。

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 凈化方式的確定

使用C18固相萃取柱和石油醚液液萃取兩種方式對(duì)樣品進(jìn)行凈化。比較之后發(fā)現(xiàn)，石油醚雖然可以去除一部分雜質(zhì)和色素，但在實(shí)驗(yàn)過程中，石油醚處理后的提取液仍顯黃褐色，凈化效果不佳。C18柱處理過的提取液不僅色素殘留量少，而且回收率較高，所以采用C18固相萃取方法。

2.4.2 洗脫液的確定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫液甲醇體積分?jǐn)?shù)和用量進(jìn)行考察，在固相萃取柱上加赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別選取甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和100%的洗脫液進(jìn)行洗脫，每1mL收集一次過柱后的樣液，分別檢測(cè)其回收率，結(jié)果見表3。

表3 不同洗脫方式條件下的赤霉素回收率Table 3 Recovery rates of gibberellin at the conditions of different elution methods

由表3可見，當(dāng)洗脫液中甲醇體積分?jǐn)?shù)偏低時(shí)，需要大量的洗脫液以獲得較高的回收率，但此時(shí)洗脫液中赤霉素的濃度較低；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，雖然洗脫液用量減小，但同時(shí)將雜質(zhì)洗脫，凈化效果差；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，3mL的洗脫液即可將赤霉素洗脫，并且所含雜質(zhì)較少，所以確定洗脫液中甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%，洗脫體積為3mL。

2.5 色譜條件的確立

根據(jù)參考文獻(xiàn)，在赤霉素色譜分離過程中，多采用甲醇-甲酸水體系作為流動(dòng)相。為了得到較好的分離效果和較短的分析時(shí)間采用了梯度洗脫的方式，結(jié)果見圖1。

液-質(zhì)聯(lián)用方法中，常在流動(dòng)相中加入甲酸，可以提高組分的電離效率；同時(shí)赤霉素分子中含有羧基，在流動(dòng)相中加入甲酸能夠抑制其電離，改善其峰形。本實(shí)驗(yàn)考察甲酸在水相中的體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%和0.2%時(shí)赤霉素的峰形，發(fā)現(xiàn)甲酸的量對(duì)赤霉素的峰形影響不大，考慮到固定相對(duì)pH值的耐受，選擇0.2%的甲酸溶液作為流動(dòng)相。

2.6 質(zhì)譜條件的確立

在電噴霧電離源(ESI)負(fù)離子模式下，采用直接進(jìn)樣方式對(duì)赤霉素進(jìn)行分析，獲得其一級(jí)質(zhì)譜圖(圖2)。

圖2 赤霉素的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectrum of gibberellin

確定其一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z345，再以m/z345為母離子，得到其相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖4)。

圖3 赤霉素的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of gibberellin

從圖3可以確定，赤霉素的子離子主要是m/z239和m/z143，子離子m/z239的豐度最大。因此，可以確定在用質(zhì)譜分析赤霉素時(shí)，定量離子對(duì)為m/z345＞m/z239，定性離子對(duì)為m/z345＞m/z239，m/z345＞m/z143。然后再對(duì)錐孔電壓和毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)。

按實(shí)驗(yàn)確定的條件對(duì)各基質(zhì)樣品進(jìn)行處理，得到其相應(yīng)的空白圖譜和定量限添加圖譜，圖4、5是代表樣品蘿卜的相關(guān)譜圖，可以看出，樣品基質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，該方法適于蔬菜水果中赤霉素殘留的檢測(cè)。

圖4 蘿卜樣品空白圖Fig.4 Ion current chromatogram of radish blank sample

圖5 蘿卜樣品中添加赤霉素(0.02mg/kg)標(biāo)準(zhǔn)品圖Fig.5 Ion current chromatogram of radish samples spiked with gibberellin at the level of 0.02 mg/kg

2.7 方法的線性范圍和最小檢出限

分別配制0.01、0.02、0.1、0.5、1.0、10.0μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其線性方程為Y=1807872.7X－3269.5，相關(guān)系數(shù)r=0.996，線性范圍為0.01～10.0μg/mL。方法的最小檢出限為0.01μg/mL(RSN=3)。

2.8 方法的準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是衡量可靠性的指標(biāo)，色譜法的準(zhǔn)確度用添加回收率表示。對(duì)10種樣品在3個(gè)水平(0.02、0.2、1.0mg/kg)上的添加回收率和精密度結(jié)果。

表4 10種蔬菜水果中赤霉素回收率及精密度(n=5)Table 4 Recovery rate and precision of gibberellin in 10 kinds of vegetables and fruits (n=5)

由表6可知，10種樣品3種不同添加水平的平均回收率在77.0%～100.0%之間，變異系數(shù)(VC)在3.39%～10.05%之間，方法回收率和變異系數(shù)滿足農(nóng)殘分析實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)(定量檢出限在0.01～0.1mg/kg時(shí)回收率在70%～120%，變異系數(shù)小于22%；定量檢出限在0.1～1.0mg/kg時(shí)回收率在70%～110%，變異系數(shù)小于18%)要求。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的針對(duì)蔬菜、水果中赤霉素殘留的檢測(cè)方法。采用甲醇-水溶液對(duì)樣品中赤霉素進(jìn)行提取，調(diào)節(jié)pH值后用SPE-PAK C18固相萃取小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法能滿足日本及歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的限量檢測(cè)要求。

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Determination of Gibberellin Residue in Vegetables and Fruits by HPLC-MS/MS

ZHAO Ying-bo1，ZHOU Yan-ming1,*，XIN Xue1,2，WANG Yan-song3
(1. Analysis Test Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. Institute of Shenyang Grain and Oil Metering, Shenyang 110021, China；3. Shenyang Product Quanlity Supervision and Inspection Institute, Shenyang 110022, China)

A rapid and sensitive high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method for the determination of gibberellin residue in vegetables and fruits was developed. The gibberellin in samples was primarily extracted by methanol solution and further extracted by ethyl acetate after pH adjustment from 3 to 4. The extract was purified by C18 column and detected by HPLC-MS/MS with quantification through an external standard method. Linear range of gibberellin in this determination method was between 0.01μg/mL and 10.0μg/mL, and the detection limit was 0.01 μg/mL. The recovery rates of gibberellin in all samples at a spiked level ranging from 0.02 to 1.0 mg/kg were in the range of 77.0% to 100.0% with a CV of 3.39%－10.05%. The results indicated that this developed method was characteristics of high sensitivity and accuracy as wall as low detection limit, which could meet the requirement of MRL determination.

gibberellin；residue；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0209-04

2010-06-02

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目(2006-1018)

趙瑛博(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：yb_zhao1979@163.com

*通信作者：周艷明(1955—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：syauzym@163.com