尹忠平，上官新晨,*，張?jiān)录t，黎冬明，吳少福，陳繼光

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源開發(fā)與利用研究室，江西 南昌 330045)

大孔樹脂吸附純化青錢柳葉三萜化合物

尹忠平1,2，上官新晨1,2,*，張?jiān)录t2，黎冬明2，吳少福2，陳繼光2

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源開發(fā)與利用研究室，江西 南昌 330045)

為得到純度較高的青錢柳葉三萜化合物，采用大孔樹脂吸附法對青錢柳葉三萜粗提物進(jìn)行純化研究。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8樹脂對青錢柳葉三萜化合物吸附、解吸性能較好，比飽和吸附量為77.49mg/g，解吸率為85.44%，總回收率可達(dá)72.01%。AB-8樹脂動態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)表明：上柱流速增大，吸附率呈降低趨勢；隨著上柱液質(zhì)量濃度增大，吸附率先升后降；95%乙醇洗脫效果較好，10BV為合理用量；隨著洗脫流速增大，洗脫液峰濃度降低，洗脫率減小，綜合考慮以1.5mL/min較為適宜。經(jīng)AB-8樹脂純化后，三萜類物質(zhì)純度可達(dá)44.30%。

青錢柳；三萜化合物；大孔樹脂；純化

青錢柳(Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinsk)為我國特有的胡桃科青錢柳屬單種屬珍稀植物，主要分布于我國長江中下游地區(qū)，當(dāng)?shù)厝藢⑵淙~制成降糖降脂保健茶飲用已有200多年歷史，江西修水青錢柳降糖神茶系列產(chǎn)品還取得了中國原產(chǎn)地標(biāo)記保護(hù)。研究表明，青錢柳富含三萜類、黃酮類、多糖類及微量元素等功能活性成分，具有降糖、降脂、抗腫瘤、抗氧化及提高免疫力等多種功能，是良好的天然保健食品資源[1-3]。研究已經(jīng)證實(shí)，大多數(shù)三萜化合物都具有藥理活性，如抗糖尿病[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]等，在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。三萜化合物是青錢柳中一類重要的活性物質(zhì)，具有降糖、降壓等功能活性[8]，目前關(guān)于此類物質(zhì)的研究報道較少。青錢柳葉三萜粗提物中含有多糖、蛋白質(zhì)、黃酮等雜質(zhì)，純化難度較大。大孔樹脂吸附純化是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新型純化方法，具有吸附容量大、再生簡單、穩(wěn)定可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)，是分離純化三萜類、黃酮類、多糖類等物質(zhì)的重要方法[9]。本研究以大孔樹脂吸附法對青錢柳三萜粗提物的純化進(jìn)行探討，旨在為青錢柳資源的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳葉采自江西省修水縣，去除雜質(zhì)和枝桿后，常壓干燥，粉碎過60目篩備用。

AB-8、DM130、HPD100、HPD722 大孔樹脂 滄洲寶恩吸附材料科技有限公司；D3520、D4020大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-754紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HF-2.5B超聲循環(huán)提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三萜化合物檢測

參照洪艷平[10]、凌慶枝[11]等的方法。檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程如下：精確吸取對照品熊果酸溶液(90μg/mL)200、400、600、800、1000、1200、1400、1800、2200μL，分別加入具塞試管，水浴揮干。分別加入50g/L香草醛-冰乙酸和高氯酸各0.3mL和1.0mL，混勻，70℃水浴15min，迅速冷卻后加入4.0mL冰乙酸，于550nm波長處測定吸光度。測定回歸方程為：y=0.0047x－0.0166，R2=0.9977，式中，y為吸光度，x為熊果酸量/μg。

1.3.2 三萜化合物提取

準(zhǔn)確稱量青錢柳葉干粉(60℃干燥至質(zhì)量恒定)，石油醚脫脂(等體積脫脂2次)，揮干石油醚，以65%乙醇超聲輔助提取30min，離心(3000r/min、10min)，同條件二次提取，合并各級提取液，真空濃縮得三萜化合物粗提物。

1.3.3 三萜粗提物純化工藝流程

三萜粗提物水溶液→上大孔樹脂層析柱→蒸餾水洗柱→不同乙醇溶液梯度洗柱→收集目標(biāo)組分(以薄板層析，L-B顯色鑒定[12])→真空濃縮干燥→純化三萜化合物

1.3.4 樹脂預(yù)處理

按廠家說明書進(jìn)行處理。

1.3.5 靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8、DM130、HPD100、HPD722、D3520、D4020大孔樹脂各1g，置于磨口三角瓶中，各加入45mL已測定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液，置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行吸附(115r/min，28℃)，至上層液吸光度恒定時終止吸附，靜置取上清液測三萜化合物質(zhì)量濃度。

比飽和吸附量(Qe)/(mg/g)=(吸附前質(zhì)量濃度－吸附后質(zhì)量濃度)×吸附液體積/樹脂質(zhì)量

1.3.5.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

將按1.3.5.1節(jié)吸附飽和的樹脂加入到60mL 95%的乙醇中，置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行解吸(115r/min，28℃)，至上層液吸光度恒定時終止解吸，靜置取上清液測三萜化合物質(zhì)量濃度。

1.3.6 動態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8樹脂，濕法上柱，蒸餾水平衡后進(jìn)行動態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)。取一定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液，以1.25mL/min的流速上柱，每1BV為1單位收集流出液，測定其三萜類物質(zhì)含量，至流出液質(zhì)量濃度接近上柱液且基本恒定時停止上柱，以流出液體積為橫坐標(biāo)、三萜類物質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)吸附曲線。

取等量三萜粗提物水溶液，分別以原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液、8倍稀釋液以相同流速上柱，同條件洗脫，測定吸附純化后的三萜類物質(zhì)含量，以分析上柱液質(zhì)量濃度對吸附效果的影響。

取等體積等質(zhì)量濃度三萜粗提物水溶液，分別以0.75、1.5、2.25、3.0mL/min的流速上柱，同條件洗脫，測定吸附純化后的三萜類物質(zhì)含量，以分析上柱流速對吸附效果的影響。

1.3.6.2 動態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8樹脂，濕法上柱，蒸餾水平衡，以一定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液上柱，至流出液三萜類物質(zhì)質(zhì)量濃度為上柱液的1/5時停止上柱，10BV蒸餾水沖洗，再以10BV的40%、60%、80%、95%乙醇梯度洗脫，以高效鋁質(zhì)薄板層析，L-B顯色鑒定，比較各梯度洗脫液中三萜類物質(zhì)的種類。

取以相同條件吸附的樹脂柱，以10BV蒸餾水沖洗，10BV 40%乙醇洗脫去雜，再分別以20BV 60%、80%、95%、100%乙醇進(jìn)行洗脫并測定洗脫液中三萜類物質(zhì)的含量，以確定洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)。

吸附后完成沖洗的樹脂柱，40%乙醇洗脫去雜，再以95%乙醇洗脫，每1BV為1單位收集流出液，測定三萜類物質(zhì)含量，繪制洗脫曲線。以不同流速進(jìn)行洗脫，繪制洗脫曲線，以確定優(yōu)選洗脫流速。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附性能比較及篩選

大孔樹脂種類繁多，因極性、孔徑、比表面積不同而對吸附液中各組分的吸附作用有強(qiáng)有弱，解吸的難易也有區(qū)別。選擇合適的樹脂是大孔樹脂吸附純化的第一步，也是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究根據(jù)吸附純化的基本原理，選擇6種樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中D3520和D4020為非極性，AB-8、HPD100和HPD722為弱極性，DM130為中等極性，以靜態(tài)吸附法對樹脂進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明：非極性的D3520和D4020對青錢柳三萜的吸附率較低，總回收率明顯低于弱極性和中等極性的樹脂；相對來說，AB-8具有較好的吸附、解吸性能，比飽和吸附量為77.49mg/g，解吸率為85.44%，總回收率可達(dá)72.01%。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇AB-8樹脂進(jìn)行下一步的動態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)。

表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附性能比較Table 1 Comparison on static adsorption and desorption capabilities of different types of macro-porous resins

2.2 AB-8樹脂動態(tài)吸附曲線

圖1 AB-8樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of AB-8 resin

取6.070mg/mL的三萜粗提物水溶液，以1.25mL/min的流速上柱，每1BV為1單位收集流出液繪制動態(tài)吸附曲線，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)上柱體積為3BV時，流出液的質(zhì)量濃度為1.208mg/mL，接近上柱液質(zhì)量濃度的1/5，達(dá)到了泄漏點(diǎn)質(zhì)量濃度。因此，AB-8樹脂吸附純化6.070mg/mL青錢柳葉三萜粗提物水溶液的處理能力為3BV。當(dāng)上柱體積達(dá)到12BV后，流出液的質(zhì)量濃度趨于平穩(wěn)，可以認(rèn)為達(dá)到了樹脂的飽和吸附點(diǎn)。為充分利用樹脂的吸附能力，可采用循環(huán)上柱或多柱串聯(lián)的形式純化三萜類物質(zhì)。

2.3 上樣速度對吸附的影響

圖2 不同上樣流速時的吸附效果Fig.2 Effect of sample solution flow rate on adsorption efficiency of AB-8 resin

不同的上樣速度，目標(biāo)物與樹脂的接觸時間不同，吸附量也因此會發(fā)生變化。由圖2可知，隨著上樣速度的增大，三萜類物質(zhì)的吸附量呈下降的趨勢，上樣速度為0.75mL/min時吸附率較高。樹脂對目標(biāo)物的吸附需要一個擴(kuò)散和接觸的過程，上樣速度過快，目標(biāo)物與樹脂還未來得及充分接觸就已下移到下一個吸附層面，以致于很快通過層析柱流出柱外，這樣就無法形成有效的吸附，同時造成譜帶的擴(kuò)散，影響分離效果。因此，以AB-8樹脂純化青錢柳葉三萜類物質(zhì)時，應(yīng)降低上樣速度以提高吸附率，但上樣速度太低會使得純化效率很低，實(shí)際應(yīng)用時可適當(dāng)提高上樣速度。

2.4 上樣質(zhì)量濃度對吸附的影響

圖3 不同上樣質(zhì)量濃度時的吸附效果Fig.3 Effect of sample solution concentration on adsorption efficiency of AB-8 resin

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，隨著上樣質(zhì)量濃度的提高，三萜類物質(zhì)的吸附率呈先升后降之勢，以2.44mg/mL的吸附效果最好。從理論上講，上樣質(zhì)量濃度越高，吸附率應(yīng)該越高，因?yàn)橘|(zhì)量濃度差越大越有利于擴(kuò)散，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明，在較低的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加質(zhì)量濃度時吸附率升高，而大于一定質(zhì)量濃度時增加質(zhì)量濃度反而會降低吸附率，主要原因可能是上樣液質(zhì)量濃度太高時，黏度較大，會阻礙目標(biāo)物擴(kuò)散，從而降低吸附率。高俠等[13]、李淑珍等[14]也報道了隨著上樣質(zhì)量濃度增加目標(biāo)物吸附率先升后降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，馮穎等[15]認(rèn)為，引起高質(zhì)量濃度時吸附率下降的原因可能是雜質(zhì)的競爭性吸附作用。

2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸液的解吸效果

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸效果Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency of AB-8 resin

結(jié)果(圖4)表明，40%乙醇洗脫液中基本上不含三萜類物質(zhì)，而大部分吸附在樹脂上的色素可被40%乙醇洗脫下來，因而三萜類物質(zhì)與色素可得到較好的分離。60%、80%、95%和100%四種體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸液中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高解吸率也呈現(xiàn)出升高的趨勢，其中95%乙醇、100%乙醇的解吸率明顯高于其他體積分?jǐn)?shù)，解吸所得目標(biāo)物的純度差別不大。因此，從解吸率的角度考慮，應(yīng)選用100%的乙醇作為洗脫劑，如果考慮到成本問題，也可以選用95%乙醇。

2.6 動態(tài)解吸曲線

圖5 AB-8樹脂動態(tài)解吸曲線Fig.5 Dynamic desorption curve of AB-8 resin

結(jié)果(圖5)表明，以95%乙醇洗脫，質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)在3～6BV，且峰形較尖、峰寬較小，其中以4BV時質(zhì)量濃度最高，10BV后三萜質(zhì)量濃度已經(jīng)很小，大部分三萜在前10BV時已解吸。因此，10BV為合理的洗脫劑用量。

2.7 不同洗脫流速的洗脫效果

圖6 不同解吸流速時的解吸曲線Fig.6 Desorption curve at different flow rates

選擇0.75、1.50、2.25、3.00mL/min四種流速進(jìn)行動態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖6)表明：隨著洗脫流速的增加，解吸量呈下降的趨勢；0.75mL/min與1.50mL/min的解吸量差異不明顯，但二者均顯著高于2.25mL/min和3.00mL/min；流速越低，洗脫峰質(zhì)量濃度越高；10BV后曲線均較為平坦。綜合考慮洗脫率和洗脫效率，1.5mL/min的洗脫流速較為合理。

2.8 純化后三萜化合物的純度

青錢柳葉三萜粗提物，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附、蒸餾水沖洗、40%乙醇沖洗去雜、95%乙醇洗脫、真空濃縮干燥，得到的純化三萜化合物為棕黃色粉末或片狀物，有光澤，純度可達(dá)44.30%。

3 結(jié) 論

3.1 所選的6種供試大孔樹脂中，AB-8對青錢柳葉三萜化合物具有較好的靜態(tài)吸附、解吸性能，比飽和吸附量為77.49mg/g，解吸率為85.44%，總回收率可達(dá)72.01%，適用于青錢柳葉三萜類物質(zhì)的純化。

3.2 采用AB-8樹脂動態(tài)吸附純化青錢柳葉三萜化合物時，對6.070mg/mL粗提物水溶液的處理能力為3BV；為獲得較好的吸附效果，應(yīng)以較低流速上樣；隨著上樣質(zhì)量濃度的提高，三萜類物質(zhì)的吸附率呈先升后降之勢，2.44mg/mL的吸附效果較好；95%乙醇可獲得較好的解吸效果，10BV為合理的解吸劑用量；洗脫流速越低，效果越好，綜合考慮洗脫效率，1.5mL/min較為合理。

3.3 經(jīng)AB-8樹脂純化后的青錢柳葉三萜化合物為棕黃色粉末或片狀物，有光澤，純度可達(dá)44.30%。

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Purification of Triterpenoids fromCyclocarya paliurusLeaves by Macro-porous Resin Adsorption

YIN Zhong-ping1,2，SHANGGUAN Xin-chen1,2,*，ZHANG Yue-hong2，LI Dong-ming2，WU Shao-fu2，CHEN Ji-guang2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Laboratory of Plant Resources Exploitation and Utilization, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to obtain triterpenoids with high purity fromCyclocarya paliurusleaves, macro-porous resin was used for purification. Results indicated that macro-porous resin revealed a static absorption mode. AB-8 resin had good adsorption capability on triterpenoids fromCyclocarya paliurusleaves, and its adsorption capacity, desorption rate and total recovery rate were 77.49 mg/g, 85.44% and 72.01%, respectively. Dynamic adsorption and desorption experiments of AB-8 resin suggested that the increasing flow rate of sample solution could result in the decrease of adsorption rate, and the increasing sample amount in resin could result in a pattern of initial increase and final decline for adsorption rate. A better elution efficiency was observed at the concentration of 95% ethanol, and 10 BV was reasonable dosage. Both peak concentration and desorption rate were declined with the increasing flow rate of eluent. The best flow rate was 1.5 mL/min. The purity of triterpenoids purified by AB-8 macro-porous resin was 44.30%.

Cyclocarya paliurus；total triterpenoids；macro-porous resin；purification

TQ028.15

A

1002-6630(2011)06-0061-05

2010-05-17

江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009BSB09100)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007GZN0214)

尹忠平(1971—)，男，講師，博士研究生，主要從事食品化學(xué)與營養(yǎng)研究。E-mail：yinzp2008@yahoo.com.cn

*通信作者：上官新晨(1962—)，男，教授，博士，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：shangguanxc_818@sina.com