楊萬根，王衛(wèi)東，孫會剛，馬美湖

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

復合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽

楊萬根1，王衛(wèi)東1，孫會剛1，馬美湖2

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

以木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶組成的復合酶對豬血紅蛋白進行水解，制備富血紅素多肽，考察底物質(zhì)量分數(shù)、加酶比例、水解pH值和水解溫度等因素對水解率、蛋白質(zhì)回收率、血紅素含量等指標的影響。結果表明：底物質(zhì)量分數(shù)是影響水解率和蛋白質(zhì)回收率指標的最重要因素；pH值是影響血紅素含量指標的最重要因素；復合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分數(shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。在此工藝條件下，豬血紅蛋白水解產(chǎn)物具有較高的蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量。

豬血紅蛋白；血紅素；多肽；復合酶；水解

我國生豬產(chǎn)量排名世界第一位，每年屠宰場產(chǎn)生的絕大多數(shù)豬血不經(jīng)利用而被直接排放入環(huán)境中，造成了嚴重的環(huán)境污染。而豬血富含蛋白質(zhì)，其中的血紅蛋白由珠蛋白和血紅素兩部分構成，是豬血中重要的營養(yǎng)成分。研究證明，豬血紅蛋白多肽具有降血壓[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]和增強人體免疫力[4]等多種生物活性，而血紅素或血紅素肽則是一種優(yōu)質(zhì)的補鐵營養(yǎng)成分，與硫酸亞鐵補鐵劑相比，血紅素鐵的生物利用率高出23%[5]。因此，酶法水解豬血紅蛋白開發(fā)富血紅素多肽產(chǎn)物具有良好的經(jīng)濟價值和重要的環(huán)保意義。由于血紅蛋白分子結構致密，以及蛋白酶具有底物專一性，所以為獲得較好的水解效果，在實際生產(chǎn)中往往采用復合酶水解蛋白質(zhì)。本實驗對木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進行復配，研究復合酶水解豬血紅蛋白的最佳工藝條件，為富血紅素多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗血紅蛋白，自制：新鮮豬血抗凝處理，紗布過濾除去纖維蛋白，4000r/min離心15min，用生理鹽水清洗沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心15min，重復兩次，沉淀物冷凍備用；木瓜蛋白酶(77.9kU/g蛋白質(zhì)) 廣州遠天酶制劑廠；AS1398中性蛋白酶(25.7kU/g蛋白質(zhì)) 房山酶制劑廠；血紅素標準品(相對分子質(zhì)量651.96) 美國Sigma公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、EDTA、檸檬酸鈉、甲醛、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銅 國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；754型分光光度計 上海分析儀器廠；JB300-D型強力電動攪拌機、DS-1型組織搗碎機 上海標本模型廠；PHS-3C型pH計 上海精密儀器儀表有限公司；LD5-2型醫(yī)用離心機 北京京立離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血紅蛋白水解液的制備工藝

用適量水稀釋豬血紅蛋白解凍液，85℃恒溫30min變性，搗碎，加水調(diào)節(jié)至預定質(zhì)量分數(shù)的底物(蛋白質(zhì))濃度，加熱至水解溫度并調(diào)節(jié)至水解pH值，然后加入4000U/g蛋白質(zhì)的復合蛋白酶水解，水解過程中用pH計測定pH值，并滴加堿液保持pH值不變。水解10h后，調(diào)pH4.5，90℃加熱30min滅酶。4000r/min離心20min所得上清液即為豬血紅蛋白水解液。

1.3.2 試驗設計

采用L9(34)正交試驗[6]研究底物質(zhì)量分數(shù)、加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)、水解pH值和溫度4種因素對水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量等指標的影響。試驗因素水平表見表1。以最佳工藝條件進行驗證實驗。

表1 富血紅素多肽制備工藝正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.3 指標測定

酶活：Folin-酚法[7]；氨基氮含量：甲醛滴定法[8]；總氮含量：微量凱氏定氮法[8]；血紅素含量：分光光度法[9]。

1.3.4 水解率的計算

1.3.5 蛋白質(zhì)回收率的計算

2 結果與分析

2.1 水解率的考察

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Orthogonal array design scheme, experimental results and range analysis

由表2極差分析可知，各因素對水解率指標的重要性為底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞溫度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)。各因素對水解率的影響如圖1所示，其中，底物質(zhì)量分數(shù)各水平的優(yōu)劣為6%＞8%＞10%，隨底物質(zhì)量分數(shù)增加，水解率下降；pH值各水平的優(yōu)劣為7.0＞7.5＞8.0，隨pH值增大，水解率下降；溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞50℃＞45℃，隨溫度升高，水解率增大；加酶比例以7:3的水解率最高，而比例9:1的水解率最低。所以，對水解率指標來說，最佳因素水平組合是底物質(zhì)量分數(shù)6%、pH7、水解溫度55℃、加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

圖1 各因素對水解率的影響Fig.1 Effect of each factor on hydrolysis degree of porcine hemoglobin

隨底物質(zhì)量分數(shù)的升高，底物的流動性變差，在10%的底物質(zhì)量分數(shù)時底物的流動性最差，不利于酶連續(xù)水解底物蛋白質(zhì)，所以隨底物質(zhì)量分數(shù)升高，水解率下降。木瓜蛋白酶主要作用于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鏈，將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵切開，生成相對分子質(zhì)量較大的肽段；AS1398蛋白酶則是一種微生物來源的水解酶，其水解專一性不強，水解產(chǎn)物以游離氨基酸和小肽為主，因此加酶比例9:1(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)的產(chǎn)物中的氨基氮含量比加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)產(chǎn)物中氨基氮含量低，故而水解率值小。董清平等[10]在比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解豬血能力時發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶水解豬血產(chǎn)物的三氯乙酸可溶氮量大于木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的三氯乙酸可溶氮量，說明形成的游離氨基酸和小肽數(shù)量大于木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物。因此，與木瓜蛋白酶相比，AS1398中性蛋白酶更有利于提高水解率指標。

2.2 蛋白質(zhì)回收率的考察

表2中的R值顯示，各因素對蛋白質(zhì)回收率指標的重要性為底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞pH(C)＞溫度(D)＞加酶比例(B)。各因素對蛋白質(zhì)回收率的影響見圖2，圖中顯示底物質(zhì)量分數(shù)6%蛋白質(zhì)回收率最高，底物質(zhì)量分數(shù)10%蛋白質(zhì)回收率最低，原因也與底物流動性有關，底物質(zhì)量分數(shù)大時底物流動性差，不利于酶的作用；pH值各水平的優(yōu)劣為7.5＞7.0＞8.0，pH7.5為最佳水平是因為pH7.5為中性蛋白酶的最適水解pH值[11]，在最適水解pH條件下中性蛋白酶的酶活最高，水解產(chǎn)生的可溶肽段數(shù)量最多。溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞45℃＞50℃，以55℃為最佳水平，這是因為在該溫度下，兩種酶的反應速度最快。加酶比例各水平的優(yōu)劣為5:5＞7:3＞9:1?？梢钥闯?，隨中性蛋白酶在復合酶中所占的比例增大，蛋白質(zhì)回收率增大，這是由于中性蛋白酶的水解產(chǎn)物主要是可溶性的小肽和游離氨基酸組成，隨中性蛋白酶所占比例增大，水解物中可溶性小肽和游離氨基酸增多。因此，對蛋白質(zhì)回收率指標而言，最優(yōu)水平組合是底物質(zhì)量分數(shù)6%、pH7.5、溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

圖2 各因素對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of each factor on protein recovery rate

2.3 血紅素含量的考察

由表2R值可知，pH值對血紅素含量指標的影響最大，各因素對血紅素含量指標的重要性為pH(C)＞溫度(D)＞底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞加酶比例(B)。各因素對血紅素指標的影響如圖3所示。pH值各水平的優(yōu)劣為8.0＞7.5＞7.0，溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞50℃＞45℃，底物質(zhì)量分數(shù)各水平的優(yōu)劣為8%＞10%＞6%，加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)各水平的優(yōu)劣為5:5＞9:1＞7:3。血紅素含量隨pH值的升高而逐漸增加，原因是隨pH值升高，蛋白質(zhì)帶凈電荷數(shù)增加，靜電排斥力使蛋白質(zhì)分子展開，原來埋藏在血紅蛋白分子內(nèi)部的血紅素暴露出來，與血紅素連接的肽鏈被酶水解的機會增加。李斌等[12]研究復合酶(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)水解豬血制備血紅素的最佳工藝條件時發(fā)現(xiàn)，復合酶的最佳水解溫度56℃，最佳加酶比例(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)0.98:1，與本實驗結果基本一致。孫騫等[13]研究血紅蛋白酶法脫色時發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶水解液的色澤比AS1398中性蛋白酶水解液淺，說明木瓜蛋白酶從豬血紅蛋白中釋放血紅素的能力比中性蛋白酶差。本實驗結果表明，中性蛋白酶所占比例最高時，血紅素含量最高，也說明中性蛋白酶釋放血紅素能力比木瓜蛋白酶強。所以對血紅素指標而言，最優(yōu)水平組合為pH8.0、溫度55℃、底物質(zhì)量分數(shù)8%、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

綜合考慮，由于對水解率和蛋白質(zhì)回收率指標而言，pH值是非重要因素，為提高血紅素含量，以pH8作為復合酶的最佳pH值；底物質(zhì)量分數(shù)6%為水解率、蛋白質(zhì)回收率兩指標的最佳水平，而對血紅素含量指標，底物質(zhì)量分數(shù)3水平之間效果相差不大，因此以6%為復合酶的最佳底物質(zhì)量分數(shù)；對水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量3個指標而言，溫度55℃都是最佳溫度；對蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量指標，加酶比例3水平之間效果相差不大，因此以水解率指標的最佳加酶比例為復合酶的最佳比例，即5:5(木瓜蛋白酶:中性中性)。因此，復合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分數(shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。驗證實驗結果為產(chǎn)物的水解率17.5%，蛋白質(zhì)回收率59.2%，血紅素含量2.8mg/L。

圖3 各因素對血紅素含量的影響Fig.3 Effect of each factor on heme content

3 結 論

對影響水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量3個重要指標的影響因素進行了研究，得到富血紅素多肽產(chǎn)物的最佳制備工藝。結果發(fā)現(xiàn)，對水解率指標，各因素的重要性為底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞溫度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)；對蛋白質(zhì)回收率指標，各因素的重要性為底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞pH(C)＞溫度(D)＞加酶比例(B)；對血紅素含量指標，各因素的重要性為pH(C)＞溫度(D)＞底物質(zhì)量分數(shù)(A)＞加酶比例(B)。綜合考慮，復合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分數(shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

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Preparation of Heme-rich Polypeptides from Porcine Hemoglobin by Enzymatic Hydrolysis

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Hui-gang1，MA Mei-hu2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to prepare a heme-rich polypeptide product, mixed papain and neutral protease were used for the hydrolysis of porcine hemoglobin. The effects of substrate concentration, mixing ratio for papain and neutral protease, hydrolysis pH and hydrolysis temperature on hydrolysis degree, protein recovery rate and heme content were investigated. The results indicated that substrate concentration was the most important factor that affects hydrolysis degree and protein recovery rate. pH was the most important factor that affects heme content. The optimal hydrolysis conditions for the preparation of heme-rich polypeptide products were substrate concentration of 6%, pH 8, hydrolysis temperature of 55 ℃ and papain-to-neutral protease ratio of 5:5. Under the optimal preparation conditions, relatively high protein recovery rate and heme content for the hydrolysis of porcine hemoglobin were achieved.

porcine hemoglobin；heme；polypeptide；enzyme complex；hydrolysis

TS251.93

A

1002-6630(2011)06-0007-04

2010-04-24

國家自然科學基金項目(30270976)

楊萬根(1974—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：yangwangen08@163.com