劉士棟，于小焱，于濤

（國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計量中心，天津300112）

超濾膜組件細菌截留性能測試方法研究

劉士棟，于小焱，于濤

（國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計量中心，天津300112）

本文回顧了國內(nèi)外在超濾膜細菌截留試驗領(lǐng)域的研究成果，對中空纖維超濾膜組件的細菌截留檢測進行了實驗研究，以期為開展超濾膜組件細菌截留性能評價測試提供實驗依據(jù)。

超濾膜；細菌截留；檢測

因為細菌及其芽孢的大小通常大于0.2μm，所以按照超濾的過濾精度足以截留住幾乎所有細菌。但是，超濾膜組件在制造和工程應(yīng)用的時候容易出現(xiàn)大孔和發(fā)生膜絲斷裂的情況，從而造成膜組件的完整性受損，從而無法對細菌進行良好的截留。我們在ASTM F838-05以及JISK3823-1990（2006）的基礎(chǔ)上進行了探索研究和試驗驗證以期建立適合我們國家檢測機構(gòu)的超濾膜組件細菌截留性能評價方法。

1 材料與設(shè)備

1.1 設(shè)備

中空纖維膜組件測試裝置（自研），E-200顯微鏡（尼康公司），THZ-98AB型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），LDZX-75KBS型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司），精密微孔濾膜（Millipore公司）。

1.2 試驗材料

中空纖維超濾膜組件（天津膜天膜科技有限公司）；試驗菌及培養(yǎng)基：試驗菌：缺陷假單胞菌1.1860(中國普通微生物菌種保藏管理中心)；培養(yǎng)基：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基、加氯乳糖肉湯培養(yǎng)基、大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基、大豆酪蛋白消化物瓊脂培養(yǎng)基（上述培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司）。

2 試驗方法與步驟

2.1 試驗原理

配制一定濃度的缺陷假單胞菌測試原液(活菌濃度A大于109C.F.U/1000mL)在一定的操作壓力下透過超濾膜組件,獲得一定濃度的濾出液（活菌濃度B一般應(yīng)大于10C.F.U/1000mL）。通過下式判斷超濾膜組件對于細菌的截留能力：

U：細菌截留性能（無量綱）；A：1000mL試驗溶液中試驗菌的活菌數(shù)（C.F.U）；B：相當(dāng)于1000mL過濾水中試驗菌的活菌數(shù)（C.F.U）。

2.2 測試菌的準(zhǔn)備

2.2.1菌種的鑒定與培養(yǎng)

確定菌種的純度進行如下鑒定操作：

a進行36h～48h培養(yǎng)。缺陷假單胞菌菌群呈帶黃的灰褐色、微膨且有光澤的圓形，在30℃條件下，36 h～48 h后其直徑變?yōu)?～2mm。

b進行革蘭氏染色。確定染色標(biāo)本為革蘭氏陰性，約（0.3～0.4）μm×（0.6～1.0）μm的桿菌，主要以單細胞存在。

c進行鞭毛染色。用油鏡觀察標(biāo)本，確認缺陷假單胞菌具有一條極鞭毛。

d進行生化特征鑒定。生化特征鑒定結(jié)果：

芽孢形成為-、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（敞開）為-、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（密封）為-、3%乙醇氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（敞開）為+、3%乙醇氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（密封）為-、吲哚為-、甲基紅為-、乙酰甲基甲醇為-、白明膠酶為-、需氧性為+、過氧化氫酶為+、細胞色素氧化酶為+、馬康基瓊脂培養(yǎng)基發(fā)育為+、硝酸鹽還原為+、脫氧核糖核酸為-。

2.2.2濃菌液的配制與濃度測量

2.2.2.1濃菌液的配制

a將保藏的菌種接種到10mL大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基中，于（30±2）℃恒溫振蕩培養(yǎng)。

b取a中培養(yǎng)的菌液2mL接種到1000mL的加氯乳糖肉湯培養(yǎng)基中，在（30±2）℃恒溫振蕩培養(yǎng)，即為濃菌液。

2.2.2.2活菌數(shù)及總菌數(shù)的測定

a測定濃菌液中的活菌數(shù)

用吸管取試驗菌液，加入葡萄糖水（1 g/L）中，配制成10-3、10-4、10-5倍的稀釋液；取0.1mL稀釋液，涂抹到活菌數(shù)測定用大豆酪蛋白消化物瓊脂培養(yǎng)基上，在（30±2）℃培養(yǎng)48 h，數(shù)出菌群數(shù)，以求得試驗菌液的活菌數(shù)。

b測定過濾水中的活菌數(shù)

取1000mL產(chǎn)水用精密微孔濾膜過濾，應(yīng)盡量去除附著在過濾膜表面的水分，然后從裝置上取下，將精密過濾膜的里面密封到活菌數(shù)測定用瓊脂培養(yǎng)基上，在（30±2）℃下倒置培養(yǎng)48 h以上，培養(yǎng)后，數(shù)出精密過濾膜上生長的菌群數(shù)，計算出相當(dāng)于樣品中的活菌數(shù)，同時按照菌種鑒定方案鑒定檢出菌是否為添加菌。

c總菌數(shù)的測定

將試驗菌液在潔凈臺內(nèi)用葡萄糖水（1 g/L）稀釋，稀釋倍率為10-3、10-4、10-5倍，對上述稀釋液分別用光學(xué)顯微鏡測定菌數(shù)，然后計算出試驗菌液中的菌數(shù)。

2.3 測試裝置的準(zhǔn)備

2.3.1試驗裝置

本次所用試驗裝置為自制，材料均采用316L不銹鋼，動力為蠕動泵，壓力表采用隔膜式壓力表，并且設(shè)計系統(tǒng)殘留體積小，易清洗，對強氧化劑不敏感。裝置如圖1。

2.3.2測試裝置的清洗

a將模型組件安裝到裝置上。

b向容器中裝入清洗用的水，啟動泵，清洗所有的管路。反復(fù)清洗污染物直至清洗干凈，然后用水沖洗。

c取下模型組件，換上試驗用超濾膜組件，向裝置中加入無菌水，關(guān)閉過濾水閥，啟動泵，在膜的一次側(cè)清洗約30min。然后，打開過濾水閥，調(diào)節(jié)膜組件進口閥，使膜組件出口壓力為0.01～0.1MPa，在膜的二次側(cè)清洗約30min。更換水進行沖洗。

2.3.3裝置的殺菌

在裝置的清洗工作完成后，向裝置中加入雙氧水或次氯酸鈉溶液，滅菌30min。

2.3.4測試用精密微孔濾膜的滅菌

用于細菌活菌數(shù)測定的平板濾膜滅菌方法：將剪好的膜片放入培養(yǎng)皿中，并加入超過膜片的蒸餾水，放入高壓滅菌鍋中滅菌。

2.4 測試步驟

2.4.1向過濾裝置中加入無菌水，啟動泵，調(diào)節(jié)膜組件進口水溫為（20～30）℃的范圍，并計算平均膜壓差和回收率。

膜壓差計算公式如下：Pmin=[（Pi+Po）/2]-Pp

Pmin：平均膜壓差（kPa）；Po：膜組件出口壓力（kPa）；Pi：膜組件進口壓力（kPa）；Pp：過濾水壓力（kPa）。

回收率應(yīng)在50%以下，計算公式如下：R=（QP/Qi）×100

R：回收率（%）；QP：過濾水流量（m3/h）；Qi：膜組件進口量（m3/h）。

2.4.2取過濾水1 000mL測定活菌數(shù)，作為空白試驗（空白試驗檢出活菌則整個試驗無效）。

2.4.3把濃試驗菌液加到容器中，并將試驗菌液濃度調(diào)節(jié)到106C.F.U./mL以上。

2.4.4加入菌液以后，取過濾水1 000mL、試驗菌液約10mL，并測定活菌數(shù)。

2.4.5計算細菌截留性能。

3 結(jié)果與討論

3.1 凝膠層的形成對截留率的影響

在溫度相同的條件下，采用不同的壓力進行超濾試驗。如圖2所示。

在相同的壓力下，隨著時間的增加溶液的通透量在減少，但減少的幅度也在減小。而在不同的壓力情況下，壓力較小時，隨著壓力的增加，透液通量增加較快，壓力越大溶液的通透量增加減緩。在過濾的開始階段，膜的污染較少，菌液流動速度較快，超濾阻力主要為超濾膜本身的機械阻力Rm，菌液通量與壓力Δ可近似用下式表達：J=ΔP／Rm，所以增加壓力就可增加溶液通透量。隨著壓力的增加，膜的污染在增強，細菌在膜表面的濃度在逐漸增大，當(dāng)細菌濃度大到某一數(shù)值就形成了凝膠層，凝膠層的形成增加了透膜阻力。菌液通量與壓力ΔP可近似用下式表達：J=ΔP/Rm+Rc+Rf，其中Rc為凝膠層阻力，Rf為污染阻力。

在壓力相同的情況下，隨著時間的增加，膜的通量在減小也說明凝膠層的逐漸形成及膜的污染在增強，見圖3。

超濾膜運行初期，膜面不會形成凝膠層，截留效率的主要貢獻因素是膜組件的機械截留。此時，是超濾膜細菌截留性能最接近由自身機械阻力所引起的截留性能的時候。隨著運行時間或壓力的增加，膜面會逐漸形成凝膠層并且會增強膜組件的截留作用。此外，凝膠層的形成還會減小菌液的濃度，從而對評價超濾膜的真實細菌截留性能產(chǎn)生影響，所以應(yīng)當(dāng)盡量減少凝膠層的形成?？梢圆扇〉拇胧┚旱牧魉?，但是在本實驗中也不能無限制增加流速，因為流速增加會加大剪切力，對于菌體有損傷。同樣，溫度的升高會使菌液粘度降低，減少濃差極化現(xiàn)象，增大膜通量，但是溫度太高同樣會對細菌產(chǎn)生損傷作用，本實驗中采用溫度為25℃～30℃。

3.2 不同運行時間對截留率的影響

試驗開始時計時，每次取產(chǎn)水100mL，濃水10mL，以下計數(shù)相當(dāng)于1000mL水中的菌數(shù)見表1。

表1 不同運行時間下細菌截留性能

由表1可以看出隨著試驗時間的增加，總菌數(shù)和濃水的活菌數(shù)，數(shù)量有較大的變化，這和濾膜對試驗菌的吸附有關(guān)，時間越長則濾餅的厚度越大，吸附的試驗菌也就越多，對試驗的影響也較大，因此在實驗操作允許的情況下，盡量縮短加入試驗菌到取樣的時間，但是考慮試驗菌液充分混勻，我們試驗選擇10min后取樣。

3.3 不同運行壓力對截留率的影響

在超濾膜允許的壓力條件下，采用相同的運行時間（10min），測試不同膜壓差下超濾膜的細菌截留性能見表2。

表2 不同壓力下細菌截留性能

由表2可以看出，在超濾膜組件的允許壓力下，試驗壓力對截留率的影響不大，但是考慮到膜的濃差極化現(xiàn)象，我們采用的壓力略低于膜的操作壓力。

3.4 濃菌液培養(yǎng)模式的確定

我們對保存菌種配置濃菌液分別進行如表3時間模式的培養(yǎng)。

表3 培養(yǎng)的時間模式

試驗菌液的濃度必須經(jīng)過嚴(yán)格的培養(yǎng)達到測定所需的菌液濃度，即106/mL以上。通過以上培養(yǎng)結(jié)果可以看出，第一代培養(yǎng)時間為24 h和第二代培養(yǎng)時間為24 h的菌長勢最好。原因是無論第一代培養(yǎng)或是第二代培養(yǎng)時間太長都會使培養(yǎng)基的養(yǎng)分耗盡，從而使試驗菌的生長提前進入衰退期，無法達到最大菌量。

綜上所述，我們采用缺陷假單胞菌作為測試菌評價超濾膜組件的細菌截留性能，試驗開始10min后取樣，操作壓力略低于超濾膜組件的操作壓力，溫度采用25℃～30℃能較為理想的評價超濾膜組件的細菌截留性能。

Research for assessing the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane

LIU Shi-dong,YU Xiao-yan,YU Tao
（National Center of Ocean Standardsand Metrology,Tianjin 300112,China）

First,we make a review of research achievement on the assession of the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane.Then experiment of the detection of bacterial retention ability of ultrafiltration membrane is designed to provide proof for the assession of the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane.

ultrafiltration membrane;bacterial retention;detection

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.01.022

O648.2+2

1008-1267（2011）01-056-04

A

超濾是介于微濾和納濾之間的一種膜過程，膜孔徑在1 nm至50 nm之間，但在實際應(yīng)用中一般不以孔徑表征超濾膜，而是以截留分子量表征。與微濾膜一樣，超濾膜也被視為多孔膜，主要用于分離溶液中的大分子、膠體和微粒。

超濾膜除了用于常規(guī)的過濾外，還被經(jīng)常用于液體的冷消毒。許多國家對于用于冷消毒的超濾膜有較高的要求，如對包囊、細菌以及病毒等有機體有較高的去除率等。法國衛(wèi)生部認為只有截留分子量不超過40000Da并且完整的超濾膜才能作為冷消毒使用；美國食品藥物管理局要求用于無菌產(chǎn)品的過濾器需要由生產(chǎn)商提供細菌截留性能參數(shù)。

在膜對有機體和微生物截留和去除研究領(lǐng)域，美國材料和試驗協(xié)會和日本工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查會發(fā)布了一些有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，例如：ASTM F838-05、ASTM D 3863-87（2003）、ASTM D 3862-80（2001）、JIS K 3835-1990（2006）、JIS K 3823-1990（2006）、JIS K3824-1990。這些標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容是以缺陷假單胞菌（ATCC19146或稱NBRC14213）懸浮液來評價液體過濾器的細菌截留性能。目前，在這一領(lǐng)域我國并未建立相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

2010-09-13

劉士棟，男，工程師，主要研究方向為微濾膜，超濾膜及反滲透膜檢測。