苗敬芝，呂兆啟，董玉瑋

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州221008)

靈芝原生質(zhì)體制備與融合條件的研究

苗敬芝，呂兆啟，董玉瑋

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州221008)

以美國大靈芝和信州靈芝為起始菌株，對其原生質(zhì)體制備和融合條件進行研究。結(jié)果表明:美國大靈芝原生質(zhì)體制備最佳條件:搖瓶培養(yǎng)4d的菌絲球，復(fù)合酶液酶解，溫度31℃，時間3h，原生質(zhì)體制備率為5.80×106個/mL，再生率為0.32‰;信州靈芝原生質(zhì)體制備最佳條件:搖瓶培養(yǎng)5d的菌絲球，復(fù)合酶液酶解，溫度31℃，時間2.5h，原生質(zhì)體制備率為4.71×106個/mL，再生率為0.24‰。兩種原生質(zhì)體最佳融合條件:促融劑PEG濃度30%，Ca2+濃度0.03mol/L，時間30min，溫度35℃，融合率0.47%。

美國大靈芝，信州靈芝，原生質(zhì)體融合，融合子

靈芝素有“仙草”之稱，是一種名貴的藥用真菌，含有多種對人體有益的活性物質(zhì)，包括靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、微量元素等，對人體具有多種生理作用，能防治腫瘤、降血糖、降血脂、清除體內(nèi)自由基、增強機體免疫力等［1－2］。隨著人們對靈芝醫(yī)療保健作用認(rèn)識的加深，對其需求日益增加，加強新品種選育研究成為靈芝產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的重要內(nèi)容。普通靈芝菌種存在有效成分含量低、穩(wěn)定性差等缺點，但是自然選育費時費力。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育優(yōu)良菌種是一種較好的方法，但目前用此技術(shù)選育靈芝菌種的報道很少。本文以美國大靈芝和信州靈芝為親本菌株，對靈芝原生質(zhì)體制備和融合條件進行探討［3］。通過原生質(zhì)體融合提高靈芝有效成分的含量，為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的靈芝菌株提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國大靈芝、信州靈芝 北京吉蕈園科技有限公司;液體搖瓶培養(yǎng)基(%) 可溶性淀粉3、酵母膏1、葡萄糖1.2、磷酸二氫鉀0.3、硫酸鎂0.15;完全再生培養(yǎng)基(%) 蛋白胨0.1、牛肉膏0.05、葡萄糖2、硫酸鎂0.05、磷酸二氫鉀0.046、磷酸氫二鉀0.1、VB20.05、VB60.01、瓊脂2;溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶 廣東省微生物研究所;甘露醇、巰基乙醇、聚乙二醇、無水氯化鈣、正丁醇等 分析純試劑。

SW－CJ－1F無菌操作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;150b生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;HZ150L恒溫培養(yǎng)搖床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;TGL－16G高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;YXQ－SG46－028A手提式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝原生質(zhì)體的制備與再生 靈芝菌種活化→搖瓶培養(yǎng)→過濾收集菌絲球，無菌水沖洗→穩(wěn)滲劑甘露醇沖洗→菌絲體轉(zhuǎn)入巰基乙醇中，振蕩處理→過濾收集菌絲體，甘露醇沖洗→離心，棄上清液取沉淀→1g菌絲體以1∶10比例加入復(fù)合酶液，酶解→過濾→濾液離心→沉淀即為原生質(zhì)體。將沉淀經(jīng)甘露醇溶解、稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)，計算原生質(zhì)體的制備率［4－5］。

將制得的原生質(zhì)體液接種到完全再生培養(yǎng)基上，在28℃下于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，記錄下培養(yǎng)皿上生長出的再生菌落的數(shù)目。

原生質(zhì)體再生率(%)=再生培養(yǎng)基上長出的菌落總數(shù)/制備的原生質(zhì)體總數(shù)×100%

1.2.2 原生質(zhì)體融合與融合子的再生 將制得的美國大靈芝和信州靈芝的原生質(zhì)體用甘露醇調(diào)節(jié)到相同濃度，等量混合，置于無菌帶塞的離心管內(nèi)，離心。沉淀加入PEG(聚乙二醇溶液)，促進原生質(zhì)體融合，加入穩(wěn)滲劑甘露醇，離心，棄上清液，用甘露醇洗滌，調(diào)原生質(zhì)體濃度，接種到完全再生培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，記錄下再生融合菌落的數(shù)目，計算融合率［6－7］。

原生質(zhì)體融合率(%)=再生的融合菌落總數(shù)/用于融合的兩親株原生質(zhì)體再生總數(shù)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 原生質(zhì)體的制備和再生影響因素

2.1.1 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響 分別取搖瓶培養(yǎng)3、4、5、6、7d的美國大靈芝和信州靈芝的菌絲球在31℃下酶解3h制備原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備率見表1。

表1 菌齡對原生質(zhì)體制備率的影響

由表1可以看出，美國大靈芝原生質(zhì)體制備率最高時的菌絲體對應(yīng)菌齡是4d，信州靈芝原生質(zhì)體制備率最高時菌絲體對應(yīng)的菌齡是5d。

細(xì)胞壁是酶底物，培養(yǎng)時間過短，菌絲體生長量不夠，不易制得較多原生質(zhì)體;培養(yǎng)時間過長，菌體老化，細(xì)胞壁加厚而變得結(jié)實，不易被酶解。因此選擇細(xì)胞壁不太結(jié)實而菌絲體生長量又足夠的對數(shù)生長中期。2.1.2 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 美國大靈芝和信州靈芝的菌絲球在31℃下酶解制備原生質(zhì)體，分別取不同的酶解時間1.5、2、2.5、3、3.5h，原生質(zhì)體制備率見表2。

由表2可以看出，美國大靈芝原生質(zhì)體制備率最高時對應(yīng)的酶解時間為3h，信州靈芝原生質(zhì)體制備率最高時對應(yīng)的酶解時間為2.5h。

表2 酶解時間對原生質(zhì)體制備率的影響

在起始階段，隨著酶解時間增加，原生質(zhì)體制備率增加，到達(dá)一定值時，繼續(xù)增加酶解時間，原生質(zhì)體制備率下降。這是因為充分酶解后，繼續(xù)增加酶解時間，由于酶對部分原生質(zhì)體的進一步降解而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，也有部分原生質(zhì)體自然破裂。

2.1.3 酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響 美國大靈芝和信州靈芝的菌絲球，分別采用不同的酶解溫度25、28、31、34、37℃，酶解3h，原生質(zhì)體制備率見表3。

表3 酶解溫度對原生質(zhì)體制備率的影響

由表3可以看出，美國大靈芝原生質(zhì)體制備率最高時對應(yīng)的的酶解溫度為31℃，信州靈芝原生質(zhì)體制備率最高時對應(yīng)的酶解溫度也是31℃。

酶解溫度太低，酶的活力也低，不利于細(xì)胞壁的去除;溫度太高，酶容易失去活力，且細(xì)胞容易破碎或失去活性，影響再生。因此要選擇適宜的酶解溫度。

2.1.4 原生質(zhì)體的再生及再生率 原生質(zhì)體的再生選擇完全再生培養(yǎng)基，在最適生長溫度28℃下于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，觀察其生長情況并記錄下培養(yǎng)皿上生長出的再生菌落的數(shù)目。結(jié)果表明，美國大靈芝原生質(zhì)體的再生率為0.32‰，信州靈芝原生質(zhì)體的再生率為0.24‰。

2.2 原生質(zhì)體的融合和再生影響因素

2.2.1 PEG濃度對原生質(zhì)體融合率的影響 美國大靈芝和信州靈芝原生質(zhì)體融合時，分別采用不同的PEG濃度:20%、25%、30%、35%、40%，Ca2+濃度0.03mol/L，溫度35℃，時間30min。結(jié)果見表4。

表4 PEG濃度對原生質(zhì)體融合率的影響

由表4可以看出，美國大靈芝和信州靈芝融合時，PEG的濃度為30%能夠使融合率達(dá)到最高。

在起始階段，隨著PEG的濃度增加，融合率增加，當(dāng)融合率達(dá)到一定值時繼續(xù)增大PEG濃度，融合率反而下降。這是因為PEG既是誘導(dǎo)劑又是穩(wěn)定劑，當(dāng)濃度過低時會使原生質(zhì)體破裂而失去穩(wěn)定性，濃度過高又會引起原生質(zhì)體失水收縮，且濃度過高，PEG還會有一定毒性，影響融合子的再生。因此要選擇適宜PEG濃度。

2.2.2 Ca2+濃度對原生質(zhì)體融合率的影響 美國大靈芝和信州靈芝融合時融合劑中加入不同濃度的Ca2+:0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，PEG 濃 度30%，溫度35℃，時間30min。結(jié)果見表5。

表5 Ca2+濃度對原生質(zhì)體融合率的影響

由表5可以看出，美國大靈芝和信州靈芝融合時，Ca2+濃度為0.03mol/L能夠使融合率達(dá)到最高。

Ca2+對原生質(zhì)體融合有促進作用，這是因為帶負(fù)電荷的PEG和帶正電荷的鈣離子因細(xì)胞膜表面分子相互作用，使原生質(zhì)體表面形成電極性，致使原生質(zhì)體之間相互易于吸附而發(fā)生融合。因此適宜的Ca2+濃度對原生質(zhì)體融合起著重要作用。

2.2.3 溫度對原生質(zhì)體融合率的影響 美國大靈芝和信州靈芝融合時采用不同的溫度:25、30、35、40、45℃，PEG濃度30%，Ca2+濃度為0.03mol/L，時間30min。結(jié)果見表6。

表6 融合溫度對原生質(zhì)體融合率的影響

由表6可以看出，美國大靈芝和信州靈芝融合時，溫度為35℃可以使融合率達(dá)到最高。

適當(dāng)?shù)娜诤蠝囟纫环矫婵梢越档蚉EG溶液的黏度，使原生質(zhì)體比表面增加，增加原生質(zhì)體相互之間的接觸面積，另一方面也能夠使細(xì)胞膜的流動性增加，使之有利于原生質(zhì)體的融合。

2.2.4 時間對原生質(zhì)體融合率的影響 美國大靈芝和信州靈芝融合時采用不同的時間:25、30、35、40、45min，PEG濃度30%，Ca2+濃度為0.03mol/L，溫度35℃。結(jié)果見表7。

由表7可以看出，美國大靈芝和信州靈芝融合時的融合時間為30min可以使融合率達(dá)到最高。

表7 融合時間對原生質(zhì)體融合率的影響

融合時間過短，則原生質(zhì)體之間不能得到充分融合，融合率低;時間過長，由于PEG對原生質(zhì)體有一定毒性，影響原生質(zhì)體的活性，融合率降低。因此要選擇適宜的融合時間。

2.2.5 融合子的再生及融合率 融合子再生選擇完全再生培養(yǎng)基，在最適生長溫度28℃下，于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，觀察生長情況并記錄培養(yǎng)皿上生長出的融合菌落數(shù)目。由此得出，美國大靈芝和信州靈芝在最佳融合條件下的融合率為0.47%。

3 結(jié)論

3.1 美國大靈芝原生質(zhì)體制備的最佳條件:培養(yǎng)4d的菌絲球，復(fù)合酶液酶解3h，酶解溫度31℃，原生質(zhì)體制備率為5.80×106個/mL，再生率為0.32‰。

3.2 信州靈芝原生質(zhì)體制備的最佳條件:培養(yǎng)5d的菌絲球，復(fù)合酶液酶解2.5h，酶解溫度31℃，原生質(zhì)體制備率為4.71×106個/mL，再生率為0.24‰。

3.3 兩種原生質(zhì)體融合的最佳條件為:PEG濃度30%，Ca2+濃度 0.03mol/L，溫度為 35℃，時間為30min，融合率為0.47%。

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［2］程星燁，石鉞.靈芝活性成分的提取與檢測［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(5):170－173.

［3］肖信發(fā).微生物原生質(zhì)體融合與菌種選育［J］.抗生素，1983，8(4):261－265.

［4］徐新麗，謝必峰.深黃被孢霉3.3410原生質(zhì)體的制備和再生研究［J］.生物技術(shù)，2009，19(2):46－48.

［5］李蕤，馬守能，劉群，等.香菇菌絲原生質(zhì)體制備及融合條件的研究［J］.安徽大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，25(3):99－103.

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Research on preparation and fusion of Ganoderma lucidum protoplasts

MIAO Jing－zhi，LV Zhao－qi，DONG Yu－wei
(College of Food Biology Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China)

The time and the temperature of treatment of enzyme were studied to find out the effects on formation and regeneration of protoplasts of big Ganoderma lucidum of America and Ganoderma lucidum of Shinshu.The following conclusions were obtained:The optimum conditions for formation and regeneration of protoplasts of big Ganoderma lucidum of America were obtained by using 4－day－cultured mycelia，the enzyme mixed with 2%lywallzyme，1%snailase and 1%cellulase，temperature of treatment of enzyme was 31℃，time of treatment of enzyme was 3h，regenerated by CYM，the rate of formation was 5.80×106/mL，the rate of regeneration was 0.32‰.The optimum conditions for formation and regeneration of protoplasts of Ganoderma lucidum of Shinshu were obtained by using 5－day－cultured mycelia，the enzyme mixed with 2%lywallzyme，1%snailase and 1%cellulase，temperature of treatment of enzyme was 31℃，time of treatment of enzyme was 2.5h，regenerated by CYM，the rate of formation was 4.71×106/mL，the rate of regeneration was 0.24‰.The suspension of protoplasts were regulated into same concentration and being mixed，using different concentrations of PEG 4000，changing different concentrations of Ca2+，using different time and temperature on fusion.The optimum conditions on fusion were:concentration of PEG was 30%，concentration of Ca2+was 0.03mol/L，time on fusion was 30min，temperature on fusion was 35℃，and the fusion frequency was 0.47%.

big Ganoderma lucidum of America;Ganoderma lucidum of Shinshu;protoplast fusion;fusant

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0198－03

2010－04－16

苗敬芝(1964－)，女，副教授，研究方向:食品生物技術(shù)。

江蘇省教育廳高校自然科學(xué)研究計劃指導(dǎo)項目(08KJD18002)。