劉 潔，張海霞，胡小松，陳 芳，*

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

添加甘氨酸對天冬醇胺/葡萄糖模擬體系中丙烯醇胺形成的抑制作用

劉 潔1，張海霞2，胡小松2，陳 芳2，*

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

美拉德反應(yīng)目前被認(rèn)為是形成丙烯酰胺的重要途徑，極探討了甘氨酸在葡萄糖/天冬酰胺模擬體系中抑制丙烯酰胺形成的規(guī)律。模擬體系分別在90、100、110、120℃下反應(yīng)4h，丙烯酰胺的生成、褐變度的增加、產(chǎn)物的減少以及對天冬酰胺和甘氨酸降解動(dòng)力學(xué)的分析表明，甘氨酸的添加能夠顯著降低美拉德反應(yīng)生成的丙烯酰胺，且在該反應(yīng)體系中甘氨酸與天冬酰胺之間存在競爭關(guān)系。

丙烯酰胺，甘氨酸，美拉德反應(yīng)，模擬體系

食品安全關(guān)系到人類健康、國家安危以及社會發(fā)展。近年來，食品中有毒有害殘留和污染物逐漸受到關(guān)注，尤其是食品加工過程中產(chǎn)生的有害物成為世界各國的研究熱點(diǎn)。2002年4月，由瑞典國家食物管理局和斯德哥爾摩大學(xué)聯(lián)合宣稱，在食品中含有對人體具有潛在致癌性的丙烯酰胺，尤其是以薯?xiàng)l為代表的富含碳水化合物的高溫油炸食品中含量最為豐富［1］。這一結(jié)論立即引起世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧農(nóng)組織以及世界各國食品界的廣泛關(guān)注，在2002年4月的《Nature》雜志連續(xù)刊登了兩篇關(guān)于丙烯酰胺形成機(jī)制的文章，并認(rèn)為加熱條件下發(fā)生Maillard反應(yīng)是導(dǎo)致丙烯酰胺的主要途徑［2－3］。許多研究都證實(shí)食品加工過程中添加甘氨酸對丙烯酰胺有抑制作用［4－6］，因此本文建立了天冬酰胺/葡萄糖/甘氨酸的模擬體系，研究在不同溫度和時(shí)間下進(jìn)行加熱，甘氨酸對丙烯酰胺形成的具體影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙烯酰胺(AA)標(biāo)準(zhǔn)品(>99.9%) Sigma公司;甲醇 色譜純，美國Fisher公司;D－葡萄糖(Glc)分析純，北京化學(xué)試劑公司;L－天冬酰胺(Asn)北京科吳達(dá)生物技術(shù)發(fā)展有限公司;L－甘氨酸(Gly)美國Amresco公司。

高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)K－1001型輸液泵、K－1500溶劑混合器、K－2501型可變波長紫外檢測器 德國Knaur公司;AT－150型柱溫箱 奧德賽斯公司;868型酸度計(jì) 美國奧立龍公司;EY－300A分析天平 日本松下電器;HH－1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽 金壇市正基儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;2000D型超純水器 北京長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Asn/Glc/Gly模擬體系的建立 準(zhǔn)確量取1mL Glc溶液(0.5mol/L)、1mL Asn溶液(0.5mol/L)和1mL Gly溶液(5%)置于20mL的具塞刻度試管中，然后用0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.5)補(bǔ)充到8mL，振蕩均勻，加入沸石，加上自制冷凝裝置。將試管置于油浴鍋中，分別于90、100、110、120℃下反應(yīng)4h，每隔0.5h取樣。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.2.2 還原糖的測定方法 采用HPLC法測定還原糖含量。色譜柱為 Waters Sugar park－I(6.5×300mm，5μm)，柱溫90℃，流動(dòng)相為50mg/L乙二胺四乙酸二鈉鹽水溶液，流速為0.5mL/min，RI－2301示差檢測器，進(jìn)樣量20μL。分別取100、500、1000、2500、5000μg/mL的還原糖混標(biāo)，在上述色譜條件下用BF－2002液譜工作站繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 Asn和 Gly的測定方法 準(zhǔn)確量取樣品200μL，分別置于1.5mL離心管中，加入三乙胺乙腈溶液(14%)100μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液(1.2%)100μL，混勻，室溫放置 70min后，加入正己烷400μL，振搖后靜置10min，取下層溶液，用0.45μm膜過濾，進(jìn)行HPLC測定。HPLC條件為:Venusil－AA氨基酸分析柱(4.6mm×250mm，5μm);柱溫40℃;流動(dòng)相A/流動(dòng)相B=98/2;流速1mL/min;流動(dòng)相A:稱取15.2g醋酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加乙腈140mL，混勻;流動(dòng)相 B為80%乙腈;紫外檢測器檢測波長為254nm;進(jìn)樣量1μL。準(zhǔn)確稱取Gly和Asn各100mg，用0.1mol/L的HCl溶解并定容至100mL容量瓶中。將上述溶液配制成 150、300、600、800、1000μg/mL的混標(biāo)，經(jīng)0.45μm膜過濾，按照上述方法衍生后測定，用BF－2002液譜工作站繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 丙烯酰胺的測定方法 采用HPLC法直接測定，條件為ODS HYPERSIL柱(250×4.6mm，5μm);進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相為水∶甲醇(98∶2);檢測波長為205nm;流速為0.7mL/min;柱溫30℃。分別取50、100、250、500、750、1000、1750、3500、7000g/L的標(biāo)品溶液，按上述條件分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 褐變度 Asn/Glc/Gly體系反應(yīng)完成后，用T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)測定反應(yīng)體系溶液在420nm下的吸光度值A(chǔ)420。

2 結(jié)果與分析

2.1 Asn/Glc/Gly模擬體系中AA的形成規(guī)律

盡管隨反應(yīng)時(shí)間的延長，AA生成量呈上升趨勢(圖1)，但圖2顯示了Asn/Glc/Gly體系A(chǔ)A生成量比Asn/Glc體系［7］中AA生成量降低的百分比?？梢钥闯觯?00、110、120℃反應(yīng)4h后，Asn/Glc/Gly體系中AA的生成量比Asn/Glc體系［7］中AA的生成量分別減少了71.8%、83.9%、90.6%，說明Gly能夠顯著抑制美拉德反應(yīng)生成的AA。方差分析表明，100、110、120℃ 三者之間差異不顯著(α>0.05)，90℃與其它三個(gè)溫度則差異顯著(α＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析表明90℃下Asn/Glc/Gly體系和Asn/Glc體系的AA含量無顯著差異(α>0.05)。

2.2 Asn/Glc/Gly模擬體系的褐變度與AA生成量之間的關(guān)系

Asn/Glc/Gly模擬體系反應(yīng)4h后，測定了其在420nm的吸光度，如圖3所示。與Asn/Glc［7］體系相比較其吸光度增加，AA含量下降，進(jìn)一步說明了Gly參與了美拉德反應(yīng)，并抑制了AA的生成。

圖1 Asn/Glc/Gly模擬體系的AA含量變化趨勢

圖2 Gly對Asn/Glc/Gly模擬體系A(chǔ)A抑制趨勢

圖3 Asn/Glc/Gly在體系420nm下的吸光度變化

零級和一級動(dòng)力學(xué)方程都可以很好地?cái)M合Asn/Glc/Gly模擬體系中AA與A420之間的關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別在0.80和0.92以上。這表明我們可以根據(jù)A420的值，通過這兩個(gè)方程來預(yù)測Asn/Glc/Gly模擬體系中AA的含量，相關(guān)數(shù)據(jù)如表1、表2。方差分析表明，90、100、110℃三者之間差異顯著(α ＜0.05)，110℃與120℃之間差異不顯著(α>0.05)。

表1 Asn/Glc/Gly模擬體系中AA生成量與A420之間線性相關(guān)數(shù)據(jù)

表2 Asn/Glc/Gly模擬體系中AA生成量與A420之間相關(guān)性數(shù)據(jù)(一級動(dòng)力學(xué)方程)

2.3 Asn/Glc/Gly模擬體系中Glc、Gly和Asn的變化規(guī)律

對Asn/Glc/Gly模擬體系中的Glc、Asn、Gly進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖4～圖6。可以看出，隨著加熱溫度和時(shí)間的增加，Glc呈逐漸下降趨勢，同時(shí)伴隨著果糖(Fru)的生成。Gly與Asn也均表現(xiàn)出下降趨勢，說明這三個(gè)化合物均參與了美拉德反應(yīng)。

圖4 Asn/Glc/Gly體系Glc與Fru的含量變化趨勢

圖5 Asn/Glc/Gly體系的Asn含量變化趨勢

圖6 Asn/Glc/Gly體系的Gly含量變化趨勢

溫度對Glc、Gly和Asn的變化有顯著影響。方差分析表明，對Glc的變化趨勢100、110、120℃之間差異不顯著(α>0.05)，90℃與其它溫度之間差異顯著(α＜0.05)。對Asn的變化趨勢90℃與100℃之間差異不顯著(α>0.05)，100℃與110、120℃之間差異顯著(α＜0.05)。對Gly的變化趨勢110、120℃之間差異不顯著(α>0.05)，110℃和120℃分別與90℃和100℃之間差異顯著(α＜0.05)。

2.4 Asn/Glc/Gly模擬體系中Gly與Asn一級動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型

分別以 ln(［Gly］t/［Gly］0)與 ln(［Asn］t/［Asn］0)為y軸，反應(yīng)時(shí)間t為x軸作圖則可以得到一條直線，其斜率即為k。根據(jù)ln(C/C0)=－kt可以求出各溫度下的k值，結(jié)果見表3、表4。回歸分析表明，各溫度下Gly、Asn的變化與t之間呈顯著的直線回歸(α＜0.05)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)都在0.79～0.93之間，這說明在Asn/Glc/Gly模擬體系下，一級動(dòng)力學(xué)模型可以很好地反映Gly與Asn的降解動(dòng)態(tài)。

表3 Asn/Glc/Gly模擬體系中Asn變化的一級動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4 Asn/Glc/Gly模擬體系中Gly變化的一級動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.5 Asn/Glc/Gly模擬體系中Gly與Asn競爭反應(yīng)模型

由以上可知，Asn與Gly的降解動(dòng)態(tài)都符合一級動(dòng)力學(xué)模型。本研究以Asn一級動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)為基礎(chǔ)，可以作出不同溫度下ln(［Gly］t/［Gly］0)對ln(［Asn］t/［Asn］0)的關(guān)系圖，經(jīng)回歸分析，發(fā)現(xiàn)二者之間呈顯著的直線回歸關(guān)系(α＜0.05)，相關(guān)系數(shù)都在0.91～0.95之間。Asn/Glc/Gly模擬體系各個(gè)溫度下Gly的競爭模型分析結(jié)果見表5。

表5 Asn/Glc/Gly模擬體系Gly的競爭模型動(dòng)力學(xué)參數(shù)

比較通過一級動(dòng)力學(xué)模型推算出來的kGly和競爭模型推算出來的k′Gly，發(fā)現(xiàn)兩者非常接近，并無顯著性差異(α>0.05)?？梢姼偁幠Ｐ湍軌蚝芎玫亟忉孉sn/Glc/Gly模擬體系中Gly的變化過程，說明在Asn/Glc/Gly模擬體系中，Gly、Asn是競爭著和 Glc發(fā)生反應(yīng)的。

3 結(jié)論

通過對Asn/Glc/Gly模擬體系的研究發(fā)現(xiàn)，Gly能夠顯著抑制美拉德反應(yīng)生成的AA;Asn，Glc，Gly三個(gè)化合物均參與了美拉德反應(yīng);可以根據(jù)褐變度A420的值預(yù)測Asn/Glc/Gly模擬體系中AA的含量。另外一級動(dòng)力學(xué)模型較好地反映了90、120℃下Asn/Glc/Gly模擬體系中Gly、Asn的降解動(dòng)態(tài)，競爭模型擬合結(jié)果顯示Gly與Asn均能與Glc發(fā)生反應(yīng)，且兩反應(yīng)之間存在競爭關(guān)系。

［1］Swedish NFA.Information About Acrylamide in Food.Swedish National Food Administration，April 24，2002.http://www.slv.se/engdefault.asp.

［2］Mottram D S，Wedzicha B L，Dodson A T.Acrylamide is formed in the maillard reaction［J］.Nature，2002，419:448－449.

［3］Stadler R H，Blank I，Varga N，et al.Acrylamide from Maillard reaction products［J］.Nature，2002，419:449－450.

［4］Fink M，Andersson R，Rosén J，et al.Effect of Added Asparagine and Glycine on Acrylamide Content in Yeast－Leavened bread［J］.Cereal Chem，2006，83(2):218－222.

［5］Low M Y，Koutsidis G，Parker J K，et al.Effect of Citric Acid and Glycine Addition on Acrylamide and Flavor in a Potato Model System［J］.J Agric Food Chem，2006，54:5976－5983.

［6］Kim C T，Hwang E－S，Lee H J.Reducing acrylamide in fried snack products by adding amino acids［J］.Journal of Food Science，2005，70(5):354－358.

［7］張海霞，陳芳，袁媛，等.Asn/Glc模擬體系中丙烯酰胺形成規(guī)律的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(12):108－109.

Inhibition of acrylamide formation in asparagine/glucose model systems by glycine addition

LIU Jie1，ZHANG Hai－xia2，HU Xiao－song2，CHEN Fang2，*
(1.College of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China;2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Maillard reaction was proved as the main pathway to form acrylamide.In order to study the mechanism of inhibition of acrylamide formation in asparagine/glucose model systems by glycine addition，the model systems were heated in 90～120℃ for 4 hours.The formation of acrylamide，decrease of asparagine，glucose and glycine，increase of absorbance at 420nm and the kinetic analysis on glycine and asparagine degradation were discussed in the glucose/asparagine/glycine model reaction systems.It concluded that glycine significantly inhibited the formation of acrylamide.Glycine and asparagine competed with each other in the model systems.

acrylamide;glycine;Maillard reaction;model system

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0073－03

2009－04－17 *通訊聯(lián)系人

劉潔(1979－)，女，博士，講師，研究方向:食品安全。

國家自然科學(xué)基金(31071554);國家十一五支撐計(jì)劃課題(2009BADB9B07)。