周 波，吳吉林，朱明軍，梁世中，鐘海雁，林親錄，*

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004;2.吉首大學城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學院，湖南張家界427000;3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006)

乳酸和乳酸鈾對紅曲霉突菌株合成代謝色素及橘霉素的影響

周 波1，吳吉林2，朱明軍3，梁世中3，鐘海雁1，林親錄1，*

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004;2.吉首大學城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學院，湖南張家界427000;3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006)

主要研究了乳酸和乳酸鈉對紅曲霉突變菌株代謝合成紅曲色素和橘霉素的影響。實驗結(jié)果表明，添加一定量的乳酸和乳酸鈉都有利于紅曲色素(包括黃色素和紅色素)的合成代謝，有利于黃色素合成代謝的最適乳酸或乳酸鈉添加量在0.01～0.05mL/30mL之間，而有利于紅色素合成代謝的最適乳酸或乳酸鈉添加量在0.05～0.1mL/30mL之間，紅曲霉突變菌株利用乳酸或乳酸根作為其生長的底物和紅曲色素合成代謝的底物。乳酸或乳酸鹽本身對紅曲霉突變菌株合成代謝橘霉素沒直接的影響，其形成的發(fā)酵pH環(huán)境直接影響了橘霉素的合成代謝。

乳酸，乳酸鈉，紅曲色素，橘霉素，紅曲霉突變菌株

紅曲是一種具有東方色彩的傳統(tǒng)產(chǎn)品，在我國已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史。紅曲色素作為一種天然色素，其安全性高，經(jīng)急性毒性實驗、慢性毒性實驗以及致突變性實驗都證明其無毒，也無致畸變作用，故紅曲色素現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種食品中［1］。在食品安全問題日益受到關(guān)注的今天，由此類天然色素取代人工合成色素的前景廣闊。紅曲色素屬于聚酮類色素，由6種結(jié)構(gòu)相近的成分組成，安卡紅曲黃素(Ankaflavine)與紅曲素(Monascin)為黃色素，橙色素為紅斑紅曲素(Rubropunctatine)與紅曲玉紅素(Monascorubrine)，紅斑紅曲胺(Rubropunctamine)與紅斑玉紅胺(Monascorubramine)為紅色素。其中黃色素作為一類主要的食用色素的品種，通常占市場需求量的60%以上，故紅曲黃色素的開發(fā)研究具有廣闊的前景及重大的經(jīng)濟效益。日本目前已實現(xiàn)了紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品名為日本天然No393。紅曲黃色素在國內(nèi)已有市售產(chǎn)品，黃色素色價不到30個色價單位或黃色素色價能達到80以上色價單位，但黃色素色調(diào)不到1［1－2］。而國外的專利和文獻報道，選育出的菌株液態(tài)發(fā)酵的黃色素色價高或黃色素色調(diào)水平較高;黃色素色調(diào)能達到3～4，但黃色素色價不到60色價單位左右［3］，黃色素色價達到100色價單位左右，但是黃色素色調(diào)不到1.5［4］。泰國在這方面的研究較為突出，他們通過誘變得到單產(chǎn)黃色素的菌株，經(jīng)過二十多年的研究取得不錯的成績［5－9］，但據(jù)證實還沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。雖然紅曲霉菌合成代謝紅曲色素和橘霉素的機理還沒完全研究清楚，但是影響它們合成的關(guān)鍵酶都是聚酮合成酶，紅曲霉菌合成代謝的紅曲色素和橘霉素都是通過聚酮化合物衍生而成［10］。紅曲色素是一類聚酮化合物，以乙酰CoA為基本構(gòu)成單位聚合得到生色基團，生色基團再與脂肪酸聚合成不同的紅曲色素。紅曲橘霉素與青霉橘霉素的合成代謝途徑不同之處在于前者是以四酮體化合物為代謝分支點，后者是以五酮體化合物為代謝分支點［10］。本實驗通過物理化學誘變獲得一株高產(chǎn)黃色素的紅曲霉突變菌株(Monascus anka mutant MYM2)［11］，對其合成代謝黃色素的特性進行了一定的研究，并且也證實其合成代謝的黃色素就是Ankaflavine與 Monascin［12－15］。在本文中，根據(jù)紅曲色素和橘霉素合成代謝的相關(guān)報道［10］和本文中所用實驗菌株的實際情況，來研究乳酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響，希望提高紅曲霉突變菌株黃色素的合成代謝量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲霉突變株菌(Monascus anka mutant MYM2)

華南理工大學生化工程研究室保存;所用化學試劑 除玉米粉是從超市購買外，其余均從廣州市化學試劑廠購買，均為分析純;斜面種培養(yǎng)基 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(麥芽汁由珠江啤酒有限公司提供);種子培養(yǎng)基(g/L) 玉米粉30，硝酸鈉3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，磷酸二氫鉀4，pH6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 氯化銨15，可溶性淀粉70，葡萄糖20，玉米漿10，KH2PO45，初始pH4.0。乳酸和乳酸鈉濃度根據(jù)實驗設(shè)計需要變化，培養(yǎng)基均在121℃飽和蒸汽滅菌20min。

紫外可見分光光度計 2802SUV/VIS，上海尤尼科斯科學儀器有限公司;全溫搖床 C25KC型，美國New Brunswick Scientific公司;生化培養(yǎng)箱 SPX－250B－Z型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電子天平 ER－180A型，日本A＆D公司;液相色譜

Aglient 1100，美國安捷倫科技有限公司;超聲波細胞破碎機 Scientz IID，寧波新芝生物科技股份責任有限公司。

1.2 種子培養(yǎng)和發(fā)酵方法

斜面種在32℃下培養(yǎng)2～3d;種子液在32℃，160r/min培養(yǎng)2～3d;搖瓶發(fā)酵條件為250mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，160r/min，32℃下培養(yǎng)7d，所有發(fā)酵實驗均三個平行，計算平均值。

1.3 分析方法［16］

1.3.1 胞外色價測定 取一定體積的發(fā)酵液，4000r/min離心20min，上清液經(jīng)定性濾紙過濾，濾液經(jīng)稀釋至適當倍數(shù)，用分光光度計在波長410nm下測定其OD410值，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞外黃色素色價;在波長510nm下測得OD510乘以稀釋倍數(shù)即為胞外紅色素色價。

1.3.2 胞內(nèi)色價測定 離心后的菌體沉淀用70%乙醇抽提1h，然后4000r/min離心20min，上清液過濾，濾液經(jīng)稀釋至適當倍數(shù)，測定其OD410，此值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)黃色素色價;測得的OD510值乘以稀釋倍數(shù)即為胞內(nèi)紅色素色價。

1.3.3 總黃色素色價的計算 總黃色素色價(U/mL)=胞外黃色素色價+胞內(nèi)黃色素色價

1.3.4 色調(diào)的計算 色調(diào) =黃色素色價/紅色素色價

1.3.5 細胞干重(DCW)的測定 吸取5mL發(fā)酵液，4000r/min離心20min，去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌，4000r/min離心20min，去上清液，重復三次后沉淀于80℃烘箱中烘至恒重。

1.3.6 橘霉素的檢測 5mL發(fā)酵液用5mL 95%乙醇抽提1h，通過超聲波細胞破碎機破碎后于4000r/min離心20min，離心上清液通過濾紙過濾，濾液再用0.45μm有機系膜過濾，吸取濾液20μL來進行橘霉素色譜檢測。HPLC檢測條件:Aglient 1100的高效液相，柱為 Eclipse XDB reverse C18柱(250mm ×4.6mm，5μm顆粒大小)，柱溫28℃，檢測器為紫外檢測器(λ=254nm);流動相(用色譜純磷酸來調(diào)pH至2.5)為乙睛 ∶水(35∶65，v∶v)，流動相流速為1.0mL/min［17］。橘霉素測定標準曲線為:y=27.11x－70.647(稀釋倍數(shù)為100～300)，其中y為峰面積，x為橘霉素濃度(mg/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸對紅曲霉突變菌株代謝合成黃色素的影響

隨著乳酸添加量的增加，胞外、胞內(nèi)和總黃色素色調(diào)都呈現(xiàn)下降趨勢(見表1)。但是乳酸的添加對于黃色素合成代謝的影響不同，0.01～0.1mL之間乳酸添加量較有利于黃色素(尤其是胞內(nèi)黃色素)的合成代謝，當乳酸添加量為0.01mL和0.05mL時，胞內(nèi)黃色素色價比未添加乳酸發(fā)酵時分別高出26.38%和26.96%，總黃色素色價比未添加乳酸發(fā)酵時分別高出21.44%和27.04%(見表2)。在一定濃度范圍內(nèi)，添加乳酸也有利于紅色素的合成代謝，紅色素合成代謝的情況與黃色素的基本一致(見表2和表3)。當添加0.05、0.1、0.5mL乳酸時，胞內(nèi)紅色素色價和總紅色素色價比未添加乳酸發(fā)酵時的要高，胞內(nèi)紅色素色價分別高出31.53%、64.64%和26.06%，總紅色素色價分別高出32.88%、61.70%和41.14%。這說明一定量的乳酸有利于紅曲霉突變菌株合成代謝紅曲紅色素和紅曲黃色素。

表1 乳酸對紅曲黃色素色調(diào)的影響

乳酸添加量在0.01～0.1mL之間時，細胞干重雖然有所增加，但不很明顯，如當乳酸添加量為0.01、0.05、0.1mL時，細胞干重比未添加乳酸發(fā)酵時分別高出2.10%、5.40%和13.20%(見表4)，這說明乳酸對紅曲霉突變菌株的生長沒明顯有利影響，發(fā)酵液最終pH隨著乳酸添加量(0.01～1mL)的增大而上升，且上升幅度較大(1.86～6.24)，這說明在發(fā)酵過程中，紅曲霉突變菌株利用乳酸來作為菌生長或合成代謝產(chǎn)物的底物，乳酸被利用后的某些產(chǎn)物導致了發(fā)酵液pH上升，這還有待進一步的研究。而當乳酸添加量為5mL時，細胞干重非常小，那是因為乳酸添加過多，造成極低pH發(fā)酵環(huán)境，抑制了紅曲霉突變菌株的生長。

表2 乳酸對紅曲黃色素代謝合成的影響

表3 乳酸對紅曲紅色素代謝合成的影響

表4 乳酸對紅曲黃色素發(fā)酵情況的影響

乳酸添加量在0.05mL以下時，橘霉素的合成代謝量與沒添加乳酸時相比，差異不明顯，當添加量為0.1mL時，橘霉素合成代謝量高出沒添加乳酸發(fā)酵時的72.22%，但繼續(xù)增加乳酸添加量時，在發(fā)酵液中檢測不到橘霉素的存在(見表4)。本文實驗中，橘霉素的合成代謝的變化情況與已報道的一致［13］:發(fā)酵液pH環(huán)境維持在3～5之間時能促進橘霉素的合成代謝，發(fā)酵液pH環(huán)境過高或過低反倒消除了橘霉素的合成代謝。乳酸添加量為5mL時檢測不到橘霉素的存在，是因為紅曲霉突變菌株生長不正常所造成的。這在一定程度上說明乳酸本身可能沒有參與橘霉素的合成代謝。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，認為乳酸可以作為紅曲霉突變菌株生長的底物及其紅曲色素合成代謝的一種底物，并且乳酸影響橘霉素的合成代謝是因為其形成的發(fā)酵液pH環(huán)境而不是乳酸本身參與橘霉素的合成代謝，但是這還有待進一步實驗證明。

2.2 乳酸鈉對紅曲霉突變菌株代謝合成黃色素的影響

在乳酸實驗研究中，乳酸對紅曲霉突變菌株生長影響不明顯的可能原因之一是因為乳酸形成的pH環(huán)境造成的，為此選擇乳酸鈉作進一步的實驗驗證。

從表5得知，乳酸

鈉添加量在0.05mL以下時，黃色素色價相對于未添加乳酸鈉而言都有所提高，但不明顯，胞內(nèi)黃色素色價增加量不超過5%，總黃色素色價增加量不超過 6%。而乳酸鈉添加量在0.05mL以上時，對胞內(nèi)黃色素色價和總黃色素色價有不利影響。

表5 乳酸鈉對紅曲黃色素代謝合成的影響

乳酸鈉添加量為0.1mL時，胞內(nèi)紅色素色價和總紅色素色價都有明顯提高，相對于未添加乳酸鈉而言分別高出122.67%和117.79%，再增加乳酸鈉添加量時，胞內(nèi)紅色素代謝合成量下降(見表6)。

表6 乳酸鈉對紅曲紅色素代謝合成的影響

從表7中得知，乳酸鈉添加量在0.01～0.1mL之間，細胞干重有所提高，分別高出對照組5.23%、20.24%和10.60%，說明此濃度范圍內(nèi)添加乳酸鈉有利于菌的生長，但過多乳酸鈉的添加不利于菌的生長，如5mL乳酸鈉的添加。因為乳酸鈉為強堿弱酸鹽，隨著乳酸鈉添加量的提高，紅曲霉突變菌株消耗乳酸根而導致發(fā)酵環(huán)境pH上升，從而不利于紅曲霉突變菌株的生長。隨著乳酸鈉添加量的增加，橘霉素的合成代謝量提高，如當乳酸鈉添加量為0.1mL時，橘霉素的合成代謝量高出未添加乳酸鈉時的52.63%，但是繼續(xù)增加乳酸鈉時，在發(fā)酵液中就檢測不到橘霉素的存在(見表7)，這是因為隨著乳酸鈉添加量的增加，發(fā)酵環(huán)境的pH上升，消除了橘霉素的合成代謝。這說明一定量的乳酸鈉能促進橘霉素的合成代謝也能消除橘霉素的合成代謝，但都跟發(fā)酵液 pH的高低有關(guān)，而非乳酸鈉本身［13］。

表7 乳酸鈉對紅曲黃色素發(fā)酵情況的影響

3 結(jié)論

乳酸和乳酸鈉的實驗結(jié)果表明，在本文研究范圍內(nèi)，添加一定量的乳酸和乳酸鈉都有利于紅曲色素(包括黃色素和紅色素)的合成代謝，有利于黃色素合成代謝的最適乳酸和乳酸鈉添加量在0.01～0.05mL/30mL之間，有利于紅色素合成代謝的最適乳酸添加量在0.05～0.1mL/30mL之間，而乳酸鈉的最適添加量為0.1mL/30mL。紅曲霉突變菌株可以利用乳酸或乳酸根作為菌生長的底物和紅曲色素合成代謝的底物。乳酸或乳酸鹽本身對紅曲霉突變菌株合成代謝橘霉素沒任何直接的影響，而是其造成的發(fā)酵pH環(huán)境影響了橘霉素的合成代謝。

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Effect of lactic acid and sodium lactic acid on the pigments and citrinin production by Monascus anka mutant

ZHOU Bo1，WU Ji－lin2，ZHU Ming－jun3，LIANG Shi－zhong3，ZHONG Hai－yan1，LIN Qin－lu1，*
(1.School of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China;2.College of Resources and Planning Sciences，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China;3.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China)

The effect of lactic acid and sodium lactic acid on Monascus pigments and citrinin production by Monascus anka mutant MYM2 were researched.The results indicated that lactic acid and sodium lactic acid were beneficial for Monascus pigments(including red and yellow pigments)production by Monascus anka mutant，the best addition concentration of lactic acid or sodium lactic acid for yellow pigments production was between 0.01mL and 0.05mL per 30mL cultures，but for red pigments production，it was between 0.05mL and 0.1mL per 30mL cultures.Lactic acid and lactic acid ion could be used as substrates for Monascus pigments production and growth of Monascua anka mutant MYM2.It was the pH of cultures established by the lactic acid or sodium lactic acid directly influenced the citrinin production by Monascus anka mutant MYM2.

lactic acid;sodium lactic acid;Monascus pigments;citrinin;Monascus anka mutant

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0185－04

2010－03－26 *通訊聯(lián)系人

周波，男，研究方向:微生物發(fā)酵工程。