莫繼先，高學(xué)軍

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

鹽析法從牛初乳中提取IGF-1工藝條件研究

莫繼先1，高學(xué)軍2，*

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

目的:用鹽析法從牛初乳中提取IGF－1，確定最佳鹽析飽和度。方法:以新鮮牛初乳為原料，調(diào)脫脂乳等電點(diǎn)至4.2完全除去酪蛋白，收集乳清后選擇不同飽和度硫酸銨鹽析，SDS－PAGE、ELISA方法確定最佳鹽析飽和度。結(jié)果:制備牛初乳IGF－1硫酸銨鹽析飽和度為35%，產(chǎn)品回收率為75.338%，純度為16.694×10－3%。結(jié)論:硫酸銨鹽析制備IGF－1效率高，成本低，35%飽和度鹽析時(shí)為最佳制備IGF－1的飽和度。

牛初乳，IGF－1，鹽析

從牛初乳中提取各種功能蛋白質(zhì)來替代人乳一直是乳品工業(yè)常用的方法，理論上，適合從牛初乳中分離純化IGF－1的方法有很多，如鹽析法、層析法、高效液相色譜法、超濾法、等電點(diǎn)分子篩過濾法等［1－2］。而在這些方法中，鹽析法是一種高效實(shí)用、簡便易操作，適合于小規(guī)模制備方案采用的方法。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)把中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中后，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀［3］。目前還沒有用鹽析法從牛初乳中制備IGF－1的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

IGF－1標(biāo)準(zhǔn)品、β－酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;鼠抗人IGF－1，兔抗牛IGF－1，HRP－羊抗兔IgG，ECL Plus超敏發(fā)光液，BSA;其他常規(guī)試劑 均為分析純。

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、電泳槽、酶標(biāo)儀(Medol 680型) Bio－Rad公司;Alpha imager TM 2200凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司。

1.2 鹽析方法

量取新鮮牛初乳離心除脂肪，得到的脫脂乳調(diào)pH至4.2，離心除酪蛋白，收集乳清，然后調(diào)pH至7.0，邊攪拌邊分別加入10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%飽和度的硫酸銨鹽析，常溫靜止1h，4℃條件下5000r/min離心15min，分別收集上清液及沉淀，SDS－PAGE測定［4－5］。

1.3 ELISA方法

將上步所收集的上清液和沉淀分別進(jìn)行ELISA檢測，采用改良的雙抗體夾心方法，按照鼠抗人IGF－1—待測抗原—兔抗牛IGF－1—HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG順序進(jìn)行操作，最后加顯色底物TMB，H2SO4終止反應(yīng)。經(jīng)450nm酶標(biāo)儀測定，記錄結(jié)果，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各檢測樣品中IGF－1的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS－PAGE測定各鹽析飽和度下雜蛋白沉淀情況

鹽析條件選取飽和度分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%的硫酸銨溶液，分別對(duì)應(yīng)圖1、圖2中1～11泳道。上清液與沉淀的電泳圖說明鹽析飽和度在30%～35%和50%～55%兩個(gè)區(qū)間時(shí)有大量沉淀。

圖1 不同飽和度硫酸銨鹽析沉淀后上清電泳圖

圖2 不同飽和度硫酸銨鹽析沉淀電泳圖

2.2 各鹽析飽和度蛋白沉淀增加量曲線

對(duì)各組蛋白沉淀用PBS溶解，測定溶液中蛋白濃度，計(jì)算各組中實(shí)際蛋白沉淀的總量。圖3是500mL脫脂牛初乳在不同硫酸銨鹽析飽和度時(shí)蛋白沉淀增加量的曲線圖。由圖中可以看出，在硫酸銨鹽析飽和度為35%附近時(shí)蛋白沉淀增加量為最大，增加量為16544.4mg，說明此時(shí)鹽析飽和度效率最高。

圖3 鹽析蛋白沉淀增加量曲線

2.3 ELISA法確定最佳鹽析飽和度

2.3.1 IGF－1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制不同濃度IGF－1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)450nm酶標(biāo)儀測定，結(jié)果如圖4。

圖4 IGF－1標(biāo)準(zhǔn)品吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 牛初乳IGF－1含量的測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，500mL牛初乳鹽析后各上清液及沉淀中IGF－1含量如圖5所示。由圖可以看出，30%～40%鹽析飽和度區(qū)間實(shí)際鹽析效率基本一致。

圖5 各上清液及沉淀中IGF－1含量圖

2.3.3 最佳鹽析飽和度的確定 根據(jù)圖3，在硫酸銨鹽析飽和度為35%時(shí)，雜蛋白相對(duì)沉淀量出現(xiàn)最大，再根據(jù)圖5說明在此飽和度下的上清液中保留有絕大部分的IGF－1，少量隨雜蛋白沉淀。沉淀中的IGF－1經(jīng)過PBS溶液洗脫幾乎可以全部回收。而在50%～55%鹽析飽和度沉淀中，IGF－1隨雜蛋白一起有較大量沉淀，不利于回收目的蛋白，且硫酸銨用量也較大，故綜合以上考慮，35%硫酸銨鹽析飽和度為實(shí)驗(yàn)最佳鹽析飽和度。

2.4 牛初乳IGF－1純度及回收率

ELISA方法測定脫脂牛初乳中的牛初乳IGF－1的濃度為1.601μg/mL，計(jì)算得到500mL的牛初乳中IGF－1的含量為800.500μg;35%鹽析飽和度上清液共600mL，濃度 6.021mg/mL，經(jīng)透析濃縮后體積50mL，濃度為72.252mg/mL，ELISA檢測目的蛋白濃度為12.062μg/mL，計(jì)算目的蛋白含量為603.078μg。所以，35%硫酸銨飽和度鹽析的回收率是75.338%，純度是 16.694×10－3%，較脫脂牛初乳提高了約15～20倍，較牛初乳原液提高了約20～25倍。

3 討論

加硫酸銨鹽析之前應(yīng)先將所制備的乳清進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專驗(yàn)榈鞍诐舛冗^高，鹽析時(shí)容易發(fā)生共沉的現(xiàn)象而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。低飽和度鹽析時(shí)，大分子蛋白質(zhì)由于分子質(zhì)量較大，少量聚集就會(huì)發(fā)生沉淀，而牛初乳IGF－1是小分子蛋白質(zhì)，只有大量聚集才能沉淀，因而析出的牛初乳IGF－1較少。繼續(xù)增加硫酸銨鹽析的飽和度，當(dāng)達(dá)到35%時(shí)，沉淀的大分子量蛋白質(zhì)的量繼續(xù)增加，同時(shí)牛初乳IGF－1也開始大量沉淀;分析圖1～圖3可知，當(dāng)硫酸銨鹽析的飽和度增大到60%時(shí)，幾乎能將乳清中的所有牛初乳IGF－1析出。繼續(xù)增大硫酸銨鹽析的飽和度，對(duì)結(jié)果沒有明顯的影響，但工業(yè)生產(chǎn)上增大硫酸銨鹽析的飽和度會(huì)造成試劑的浪費(fèi)。所以選擇35%的硫酸銨鹽析飽和度。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)緩沖液洗脫仍可以將目的蛋白洗脫出，這樣保證了低飽和度的鹽析條件即可以將雜蛋白除去，又可以將目的蛋白回收。

隨著越來越多天然蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，功能蛋白質(zhì)的制備甚至產(chǎn)業(yè)化將會(huì)得到快速發(fā)展。硫酸銨鹽析法在蛋白質(zhì)的粗提過程中效率很高，并且成本很低。目前國內(nèi)還沒有用此方法生產(chǎn)IGF－1的企業(yè)，所以利用硫酸銨鹽析生產(chǎn)IGF－1將在未來蛋白質(zhì)制備中前景廣闊。

［1］Francis G L，et al.Purification and partial sequence analysis of insulin－like growth factor－1 from bovine colostrum［J］.Biochem，1986，233:207－213.

［2］Bernardinelli SE，Bottaro Castilla HR，Waehner RS，et al.Production and properties of the milk－clotting enzyme［J］.Rev Argent Microbiol，1983，15(2):95－104.

［3］高娃.硫酸銨的鹽析作用［J］.內(nèi)蒙古教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，13(9):45－46.

［4］Denisova II，Krasheniuk AI，Azhitskiǐ GIu，et al.Isolation and purification of lactoperoxidase from cow＇s milk［J］.Vopr Med Khim，1986，32(1):116－119.

［5］汪家政.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.科學(xué)出版社，2000，8.

Study on the technological conditions of extracting IGF－1 from bovine colostrum by salting－out

MO Ji－xian1，GAO Xue－jun2，*
(1.College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Objective:The IGF－1 was extracted from bovine colostrum by salting－out to find the optimum concentration of salting－out.Methods:Experimental material was fresh bovine colostrum，adjusted the isoelectric point of skim milk to 4.2，removed the casein completely，and then recovered whey，chose a different concentration of ammonium sulfate saturation，used SDS－PAGE，ELISA method to determine the optimum concentration of salting－out.Results:The ammonium sulfate saturation was 35%in the preparation of bovine colostrum IGF－1，the product recovery rate was 75.338%，the purity was 16.694×10－3%.Conclusions:The optimum concentration of salting－out was 35%.

bovine colostrum;IGF－1;salting－out

TS252.1

B

1002－0306(2011)04－0309－03

2010－03－25 *通訊聯(lián)系人

莫繼先(1982－)，男，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(GA06B201－4)。