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        鹽析法從牛初乳中提取IGF-1工藝條件研究

        2011-10-09 02:34:54莫繼先高學(xué)軍
        食品工業(yè)科技 2011年4期
        關(guān)鍵詞:增加量牛初乳鹽析

        莫繼先,高學(xué)軍

        (1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾161006;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150030)

        鹽析法從牛初乳中提取IGF-1工藝條件研究

        莫繼先1,高學(xué)軍2,*

        (1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾161006;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150030)

        目的:用鹽析法從牛初乳中提取IGF-1,確定最佳鹽析飽和度。方法:以新鮮牛初乳為原料,調(diào)脫脂乳等電點(diǎn)至4.2完全除去酪蛋白,收集乳清后選擇不同飽和度硫酸銨鹽析,SDS-PAGE、ELISA方法確定最佳鹽析飽和度。結(jié)果:制備牛初乳IGF-1硫酸銨鹽析飽和度為35%,產(chǎn)品回收率為75.338%,純度為16.694×10-3%。結(jié)論:硫酸銨鹽析制備IGF-1效率高,成本低,35%飽和度鹽析時(shí)為最佳制備IGF-1的飽和度。

        牛初乳,IGF-1,鹽析

        從牛初乳中提取各種功能蛋白質(zhì)來替代人乳一直是乳品工業(yè)常用的方法,理論上,適合從牛初乳中分離純化IGF-1的方法有很多,如鹽析法、層析法、高效液相色譜法、超濾法、等電點(diǎn)分子篩過濾法等[1-2]。而在這些方法中,鹽析法是一種高效實(shí)用、簡便易操作,適合于小規(guī)模制備方案采用的方法。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)把中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中后,中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì),于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí),中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀[3]。目前還沒有用鹽析法從牛初乳中制備IGF-1的報(bào)道。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品、β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;鼠抗人IGF-1,兔抗牛IGF-1,HRP-羊抗兔IgG,ECL Plus超敏發(fā)光液,BSA;其他常規(guī)試劑 均為分析純。

        穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、電泳槽、酶標(biāo)儀(Medol 680型) Bio-Rad公司;Alpha imager TM 2200凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司。

        1.2 鹽析方法

        量取新鮮牛初乳離心除脂肪,得到的脫脂乳調(diào)pH至4.2,離心除酪蛋白,收集乳清,然后調(diào)pH至7.0,邊攪拌邊分別加入10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%飽和度的硫酸銨鹽析,常溫靜止1h,4℃條件下5000r/min離心15min,分別收集上清液及沉淀,SDS-PAGE測定[4-5]。

        1.3 ELISA方法

        將上步所收集的上清液和沉淀分別進(jìn)行ELISA檢測,采用改良的雙抗體夾心方法,按照鼠抗人IGF-1—待測抗原—兔抗牛IGF-1—HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG順序進(jìn)行操作,最后加顯色底物TMB,H2SO4終止反應(yīng)。經(jīng)450nm酶標(biāo)儀測定,記錄結(jié)果,根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各檢測樣品中IGF-1的含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SDS-PAGE測定各鹽析飽和度下雜蛋白沉淀情況

        鹽析條件選取飽和度分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%的硫酸銨溶液,分別對(duì)應(yīng)圖1、圖2中1~11泳道。上清液與沉淀的電泳圖說明鹽析飽和度在30%~35%和50%~55%兩個(gè)區(qū)間時(shí)有大量沉淀。

        圖1 不同飽和度硫酸銨鹽析沉淀后上清電泳圖

        圖2 不同飽和度硫酸銨鹽析沉淀電泳圖

        2.2 各鹽析飽和度蛋白沉淀增加量曲線

        對(duì)各組蛋白沉淀用PBS溶解,測定溶液中蛋白濃度,計(jì)算各組中實(shí)際蛋白沉淀的總量。圖3是500mL脫脂牛初乳在不同硫酸銨鹽析飽和度時(shí)蛋白沉淀增加量的曲線圖。由圖中可以看出,在硫酸銨鹽析飽和度為35%附近時(shí)蛋白沉淀增加量為最大,增加量為16544.4mg,說明此時(shí)鹽析飽和度效率最高。

        圖3 鹽析蛋白沉淀增加量曲線

        2.3 ELISA法確定最佳鹽析飽和度

        2.3.1 IGF-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制不同濃度IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)450nm酶標(biāo)儀測定,結(jié)果如圖4。

        圖4 IGF-1標(biāo)準(zhǔn)品吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3.2 牛初乳IGF-1含量的測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,500mL牛初乳鹽析后各上清液及沉淀中IGF-1含量如圖5所示。由圖可以看出,30%~40%鹽析飽和度區(qū)間實(shí)際鹽析效率基本一致。

        圖5 各上清液及沉淀中IGF-1含量圖

        2.3.3 最佳鹽析飽和度的確定 根據(jù)圖3,在硫酸銨鹽析飽和度為35%時(shí),雜蛋白相對(duì)沉淀量出現(xiàn)最大,再根據(jù)圖5說明在此飽和度下的上清液中保留有絕大部分的IGF-1,少量隨雜蛋白沉淀。沉淀中的IGF-1經(jīng)過PBS溶液洗脫幾乎可以全部回收。而在50%~55%鹽析飽和度沉淀中,IGF-1隨雜蛋白一起有較大量沉淀,不利于回收目的蛋白,且硫酸銨用量也較大,故綜合以上考慮,35%硫酸銨鹽析飽和度為實(shí)驗(yàn)最佳鹽析飽和度。

        2.4 牛初乳IGF-1純度及回收率

        ELISA方法測定脫脂牛初乳中的牛初乳IGF-1的濃度為1.601μg/mL,計(jì)算得到500mL的牛初乳中IGF-1的含量為800.500μg;35%鹽析飽和度上清液共600mL,濃度 6.021mg/mL,經(jīng)透析濃縮后體積50mL,濃度為72.252mg/mL,ELISA檢測目的蛋白濃度為12.062μg/mL,計(jì)算目的蛋白含量為603.078μg。所以,35%硫酸銨飽和度鹽析的回收率是75.338%,純度是 16.694×10-3%,較脫脂牛初乳提高了約15~20倍,較牛初乳原液提高了約20~25倍。

        3 討論

        加硫酸銨鹽析之前應(yīng)先將所制備的乳清進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專驗(yàn)榈鞍诐舛冗^高,鹽析時(shí)容易發(fā)生共沉的現(xiàn)象而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。低飽和度鹽析時(shí),大分子蛋白質(zhì)由于分子質(zhì)量較大,少量聚集就會(huì)發(fā)生沉淀,而牛初乳IGF-1是小分子蛋白質(zhì),只有大量聚集才能沉淀,因而析出的牛初乳IGF-1較少。繼續(xù)增加硫酸銨鹽析的飽和度,當(dāng)達(dá)到35%時(shí),沉淀的大分子量蛋白質(zhì)的量繼續(xù)增加,同時(shí)牛初乳IGF-1也開始大量沉淀;分析圖1~圖3可知,當(dāng)硫酸銨鹽析的飽和度增大到60%時(shí),幾乎能將乳清中的所有牛初乳IGF-1析出。繼續(xù)增大硫酸銨鹽析的飽和度,對(duì)結(jié)果沒有明顯的影響,但工業(yè)生產(chǎn)上增大硫酸銨鹽析的飽和度會(huì)造成試劑的浪費(fèi)。所以選擇35%的硫酸銨鹽析飽和度。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)緩沖液洗脫仍可以將目的蛋白洗脫出,這樣保證了低飽和度的鹽析條件即可以將雜蛋白除去,又可以將目的蛋白回收。

        隨著越來越多天然蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),功能蛋白質(zhì)的制備甚至產(chǎn)業(yè)化將會(huì)得到快速發(fā)展。硫酸銨鹽析法在蛋白質(zhì)的粗提過程中效率很高,并且成本很低。目前國內(nèi)還沒有用此方法生產(chǎn)IGF-1的企業(yè),所以利用硫酸銨鹽析生產(chǎn)IGF-1將在未來蛋白質(zhì)制備中前景廣闊。

        [1]Francis G L,et al.Purification and partial sequence analysis of insulin-like growth factor-1 from bovine colostrum[J].Biochem,1986,233:207-213.

        [2]Bernardinelli SE,Bottaro Castilla HR,Waehner RS,et al.Production and properties of the milk-clotting enzyme[J].Rev Argent Microbiol,1983,15(2):95-104.

        [3]高娃.硫酸銨的鹽析作用[J].內(nèi)蒙古教育學(xué)院學(xué)報(bào),2000,13(9):45-46.

        [4]Denisova II,Krasheniuk AI,Azhitskiǐ GIu,et al.Isolation and purification of lactoperoxidase from cow's milk[J].Vopr Med Khim,1986,32(1):116-119.

        [5]汪家政.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].科學(xué)出版社,2000,8.

        Study on the technological conditions of extracting IGF-1 from bovine colostrum by salting-out

        MO Ji-xian1,GAO Xue-jun2,*
        (1.College of Life Sciences and Agriculture and Forestry,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

        Objective:The IGF-1 was extracted from bovine colostrum by salting-out to find the optimum concentration of salting-out.Methods:Experimental material was fresh bovine colostrum,adjusted the isoelectric point of skim milk to 4.2,removed the casein completely,and then recovered whey,chose a different concentration of ammonium sulfate saturation,used SDS-PAGE,ELISA method to determine the optimum concentration of salting-out.Results:The ammonium sulfate saturation was 35%in the preparation of bovine colostrum IGF-1,the product recovery rate was 75.338%,the purity was 16.694×10-3%.Conclusions:The optimum concentration of salting-out was 35%.

        bovine colostrum;IGF-1;salting-out

        TS252.1

        B

        1002-0306(2011)04-0309-03

        2010-03-25 *通訊聯(lián)系人

        莫繼先(1982-),男,碩士,從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

        黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(GA06B201-4)。

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