楊 昱，白靖文

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

川揀果實(shí)中川揀素不同提取方法的研究

楊 昱，白靖文*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

為了獲得川楝素最佳提取方法，以川楝果實(shí)為材料，采用高效液相色譜法檢測(cè)，通過正交實(shí)驗(yàn)，分別研究溶劑浸提法、索氏提取法和超聲波法提取川楝素的最佳提取條件。結(jié)果表明:溶劑浸提法的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度70%，液料比8∶1(mL/g)，提取時(shí)間20min，提取次數(shù)3次，川楝素得率0.482%;索氏提取法提取川楝素的最佳工藝條件為:乙醇濃度70%，液料比15∶1，提取時(shí)間4h，川楝素得率0.599%;超聲波法提取川楝素的最佳工藝條件為:乙醇濃度80%，液料比12∶1(mL/g)，提取時(shí)間35min，超聲功率450W，川楝素得率0.580%。三種提取方法進(jìn)行比較，索氏提取法川楝素得率最高，為川楝素的最佳提取方法。

川楝素，溶劑浸提法，索氏提取法，超聲波輔助提取法

川楝素Toosendanin(TSN，C30H38O11，F(xiàn)W 574)是從傳統(tǒng)驅(qū)蛔中藥楝屬植物川楝中分離出來的四環(huán)三萜類化合物，在我國古代就已被用作消化道驅(qū)蟲劑和農(nóng)業(yè)殺蟲劑。川楝素的分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)于1975年被首次確定［1］，在1980年由舒國欣等［2］進(jìn)行了修正。川楝素具有獨(dú)特的生物活性，在臨床醫(yī)學(xué)和蟲害控制方面有相當(dāng)大的應(yīng)用價(jià)值，例如川楝素是一種選擇性阻遏遞質(zhì)釋放的神經(jīng)－肌肉接頭前突觸傳遞阻斷劑［3－4］，能有效抑制肉毒桿菌中毒［5－6］，抑制昆蟲攝食和生長［7－8］。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)川楝素能有效地引發(fā)PC12細(xì)胞分化及凋亡。對(duì)來自人的前列腺、肝、中樞神經(jīng)、血液、肺及大鼠腎上腺的多種腫瘤細(xì)胞株如 PC3、BEL7404、SHSY－SY、U251、HL－60、U937、A549和MD－MB－468細(xì)胞具有廣譜的增殖抑制效應(yīng)［9－11］，因此川楝素具有發(fā)展成為新型抗癌藥物的可能性。此外，由于川楝素對(duì)害蟲有拒食、毒殺活性和防治效果，在我國已被廣泛用于無公害殺蟲劑生產(chǎn)［12］。因此對(duì)川楝素提取工藝進(jìn)行深入系統(tǒng)研究，具有重要意義。目前有關(guān)川楝素的提取工藝系統(tǒng)研究較少，本實(shí)驗(yàn)以川楝素果實(shí)為材料，分別研究了溶劑浸提法、索氏提取法和超聲波法提取川楝素的最佳提取工藝條件，并進(jìn)行了比較，以期為川楝素工業(yè)化生產(chǎn)和深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

川楝子 購自哈爾濱市三棵藥材市場(chǎng)，依據(jù)藥典所載方法鑒定為川楝的果實(shí);川楝素標(biāo)準(zhǔn)品 由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇 色譜純;所用其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JY92－2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FW80型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;SHB－3型循環(huán)水多用真空泵

鄭州杜甫儀器廠;202－AB－2電熱干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司;SPX－150－Z型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;AL104型電子天平 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;高效液相色譜儀Agilent1100 安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川楝素提取工藝流程 川楝果實(shí)洗凈→烘干粉碎→過200目篩→按一定比例加入乙醇→不同方法提取→過濾→減壓濃縮蒸干→甲醇溶解定容→HPLC檢測(cè)→計(jì)算提取率

1.2.2 川楝素含量的分析方法 精密吸取川楝素(0.51mg/mL)甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25μL注入高效液相色譜儀中，重復(fù)測(cè)定3次，以進(jìn)樣體積(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立回歸方程:y=69.732x－11.395，R2=0.9991。在選定的色譜條件下，進(jìn)樣量10μL，測(cè)定樣品溶液峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品溶液中川楝素含量。

1.2.3 溶劑浸提法提取川楝素工藝的研究 首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度、液料比、回流時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)川楝素得率的影響。為了考查各因素之間的相互影響，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定溶劑浸提法提取川楝素的最佳條件。

1.2.4 索氏提取法提取川楝素工藝的研究 先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間對(duì)川楝素得率的影響，然后設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定索氏提取法提取川楝素的最佳條件。

1.2.5 超聲波法提取川楝素工藝的研究 首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度、液料比、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)川楝素得率的影響，在此基礎(chǔ)上，以提取液中川楝素得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲波法提取川楝素的最佳條件。

1.2.6 不同提取方法的比較 選取一定質(zhì)量的川楝果實(shí)粉末，在最佳提取條件下，分別采用溶劑浸提法、索氏提取法和超聲波法提取川楝素(平行提取3次)，以川楝素平均得率為指標(biāo)，比較三種方法對(duì)川楝素得率的影響，確定提取川楝素的最佳方法。

1.2.7 HPLC檢測(cè)條件 色譜柱為Agilent－1100 C18柱;流動(dòng)相為CH3OH/H2O;梯度洗脫速度為甲醇/水在20min內(nèi)由40%～100%(v/v);流速為1.0mL/min;柱溫為25℃;檢測(cè)波長為215nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑浸提法提取川楝素工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定溶劑浸提法提取川楝素的適宜條件為:乙醇濃度60%，液料比8∶1(mL/g)，回流時(shí)間30min，提取次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1極差分析可知，影響川楝素提取效果的因素順序?yàn)锳>D>B>C，即乙醇濃度>提取次數(shù)>液料比>回流時(shí)間。由表2方差分析表明，乙醇濃度影響具有極顯著性(P＜0.01)，提取次數(shù)的影響不十分顯著(0.10>P>0.05)，液料比影響不具有顯著性(P>0.10)。溶劑浸提法的最佳工藝組合為A3B2C1D3，即乙醇濃度70%，液料比8∶1(mL/g)，回流時(shí)間20min，提取次數(shù)3次，此條件下川楝素得率為0.485%。

表1 溶劑浸提法提取川楝素正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 溶劑浸提法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.2 索氏提取法提取川楝素工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定索氏提取法提取川楝素的適宜工藝條件為:乙醇濃度70%，液料比15∶1，提取時(shí)間3h，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 索氏提取法提取川楝素正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3極差分析可知，影響川楝素提取效果的因素順序?yàn)锳>B>C，即乙醇濃度>液料比>提取時(shí)間。經(jīng)表4方差分析可知，乙醇濃度影響具有顯著性，液料比和提取時(shí)間影響不具有顯著性。最優(yōu)工藝組合為A2B2C3，即乙醇濃度70%，液料比15∶1，提取時(shí)間4h，在此條件下川楝素得率為0.595%。

表4 索氏提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.3 超聲波法提取川楝素工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定超聲波輔助提取川楝素適宜條件為:乙醇濃度為70%，液料比14∶1，提取時(shí)間30min，超聲功率450W，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表5。

表5極差分析可知，影響川楝素提取效果的因素為A>D>C>B，即乙醇濃度>超聲功率>超聲時(shí)間>液料比。經(jīng)表6方差分析可知，乙醇濃度影響具有顯著性，超聲時(shí)間的影響不具有顯著性。最佳工藝條件為 A3B1C3D2，即乙醇濃度80%，液料比12∶1(mL/g)，提取時(shí)間35min，超聲功率450W，此條件下川楝素得率為0.579%。

表5 超聲波法提取川楝素正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 超聲波法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.4 不同提取方法對(duì)川楝素得率的影響

由表7可知，溶劑浸提法、索氏提取法和超聲波法相比較，其中索氏提取法為最好，因此確定川楝素的最佳提取方法為索氏提取法。

表7 不同提取方法對(duì)川楝素得率的影響

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)三種提取方法的對(duì)比，川楝素的最佳提取方法為索氏提取法，其最優(yōu)工藝參數(shù)為:乙醇濃度70%，液料比15∶1，提取時(shí)間4h，在此條件下川楝素得率為0.599%。所研究的實(shí)驗(yàn)因素對(duì)川楝素得率的影響次序?yàn)?乙醇濃度>液料比>提取時(shí)間。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，索氏提取法川楝素得率比超聲波法略高，但索氏提取法存在提取時(shí)間長，能耗高的缺點(diǎn);而超聲波法作用時(shí)間短、提取溫度低、操作簡單，更易于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］鐘熾昌，謝晶曦，陳淑鳳，等.川楝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1975，3(1):35－47.

［2］舒國欣，梁曉天.關(guān)于川楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)的修正［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1980，38(2):196－198.

［3］沈國光，卓曉亮，施玉樑，等.川楝素在大腦皮層勻漿中的結(jié)合位點(diǎn)［J］.生理學(xué)報(bào)，1994，46(6):546－552.

［4］Xu TH，Shi YL，Ren XM，Zhou JY.Inhibition of glutamate release from rat cerebral synaptosomes by a prejunctional blocker toosendanin［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2004，18(2):321－326.

［5］Shi YL，Wang ZF.Cure of experimental botulism and antibotulismic effect of toosendanin［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25(6):839－848.

［6］李培忠，鄒鏡，繆武陽.川楝素對(duì)肉毒中毒動(dòng)物的治療效果［J］.中草藥，1982，13(6):28－30.

［7］趙善歡，張興.植物殺蟲劑對(duì)水稻三化螟的拒食及內(nèi)吸毒力實(shí)驗(yàn)［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1982(2):55－62.

［8］馬志卿，張興.植物源殺蟲物質(zhì)的作用特點(diǎn)［J］.植物保護(hù)，2000，26(6):37－39.

［9］ShiYL，LiMF.Biologicaleffects oftoosendanin，a triterpenoid extracted from Chinese traditional medicine［J］.Prog Neurobiol，2007，82(1):1－10.

［10］Tang MZ，Wang ZF，Shi YL.Toosendanin induces outgrowth of neuronal processes and apoptosis in PC12 cells［J］.Neurosci Res，2003，45(2):225－231.

［11］Tang MZ，Wang ZF，Shi YL.Involvement of cytochrome c release and caspase activation in toosendanin－induced PC12 cell apoptosis［J］.Toxicology，2004，201(1－3):31－38.

［12］Sara J Boake，Marelle G Boersma，Gerrit M Alink.Safety evaluation of neem(Azadirachta indica)derived pesticides［J］.J Ethnopharmacology，2004，94(1):25－41.

Optimization and comparison of different extraction techniques of toosendanin from Toosendan fruit

YANG Yu，BAI Jing－wen*
(College of Science of Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China)

In order to obtain the best toosendanin extraction method，solvent extraction，Soxhlet extraction and ultrasonic technique were separately adopted detected by HPLC to extract toosendanin from Toosendan fruit.The three extraction techniques were optimized by orthogonal array design.The optimal conditions for solvent extraction were as follows:ethanol concentration 70%，liquid/material ratio 8∶1(mL/g)，extraction time 20min，extraction times 3，and under these conditions a average toosendanin yield of 0.482%was achieved.The Soxhlet extraction technique achieved an average yield of 0.599%under the optimized conditions as follows:ethanol concentration 70%，liquid/material ratio 15∶1(mL/g)，extraction time 4h.The optimal ultrasonic－assisted extraction were as follows:ethanol concentration 80%，liquid/material ratio 12∶1(mL/g)，extraction time 35min，ultrasonic power 450W，and under these conditions average yield of toosendanin was 0.580%.The results showed that compared to the other two extraction techniques，Soxhlet extraction was the most effective approach for preparing toosendanin from Toosendan fruit.

toosendanin;solvent extraction;Soxhlet extraction;ultrasonic－assisted extraction

TS201.1

B

1002－0306(2011)04－0240－03

2010－04－16 *通訊聯(lián)系人

楊昱(1977－)，女，講師，研究方向:天然產(chǎn)物提取及應(yīng)用研究。

哈爾濱青年科技創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目(2009RFQXN099)。