李 欣，王步軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，北京100081)

超高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定苦蕎麥中黃酮類化合物

李 欣，王步軍*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，北京100081)

建立苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚含量的超高效液相色譜－串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC－MS－MS)測定方法。試樣用甲醇超聲波提取，HSSC18超高效液相色譜柱、甲醇－水(0.1%甲酸)流動相分離，以電噴霧離子源負(fù)離子檢測方式進(jìn)行質(zhì)譜分析，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量。結(jié)果表明，在0.1～100μg/mL范圍內(nèi)，蘆丁、槲皮素、山萘酚濃度與峰面積均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。在低、中、高3個濃度添加水平下，三種物質(zhì)的回收率均在94%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.19～12.54范圍內(nèi)。蘆丁檢出限為0.01ng/mL，槲皮素、山萘酚檢出限為0.1ng/mL。

苦蕎麥，超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，黃酮類化合物

苦蕎麥俗稱苦蕎，學(xué)名韃靼蕎麥(Tartarian Buckwheat)，屬雙子葉蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum esculentum)植物，在我國西南山區(qū)如重慶、四川有廣泛種植［1］?？嗍w麥具有十分豐富的營養(yǎng)價值，其中的蛋白質(zhì)、脂肪含量均高于小麥粉和大米;VB2含量高于大米、小麥粉2～10倍;鉀、鎂、鐵明顯高于大米、小麥粉;蘆丁(VP)和葉綠素更是谷類作物所沒有的。與甜蕎相比，苦蕎麥蛋白質(zhì)高1.7倍，脂肪含量高1.6倍，VB2含量高1.7倍，VP含量高12～14倍［2］。苦蕎麥所含營養(yǎng)成分當(dāng)中，特別值得注意的是它所含有的其它禾谷類糧食中所沒有的生物類黃酮物質(zhì)。黃酮類化合物是一組存在于植物中的天然產(chǎn)物，屬于植物次級代謝產(chǎn)物［3－4］，研究表明這些活性成分有防治心腦血管疾病、降低血脂、防治糖尿病等多種療效［5－6］。本研究應(yīng)用UPLC－MS－MS聯(lián)用技術(shù)研究了苦蕎麥中的黃酮類成分提取、分離和分析方法，目的是建立苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚的測定方法，為深入研究苦蕎麥營養(yǎng)價值和產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麥皮粉 購自西昌航飛苦蕎麥開發(fā)中心;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購于中國藥品生物制品檢定所;槲皮素和山萘酚標(biāo)準(zhǔn)品 購于北京益利生物制品有限公司，甲醇(色譜純) 美國Fisher公司;甲酸 分析純;水 超純水。

ACQUITY Ultra Performance LC－Xevo TQ MS質(zhì)譜儀 美國Waters公司，配有ESI源，Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);超聲波清洗器(昆山KQ－300DE) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 稱取蘆丁對照品10mg(精確到0.0001g)，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液(每1mL中含蘆丁0.2mg);稱 取 槲 皮 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 2.5mg(精 確 到0.00001g)，溶于100mL甲醇，即得槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(每1mL中含槲皮素25μg);稱取山萘酚標(biāo)準(zhǔn)品0.5mg(精確到0.00001g)，溶于50mL甲醇，即得山萘酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液(每1mL中含山萘酚0.01mg)。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 用甲醇:0.1%甲酸水(90∶10)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.1.3 苦蕎麥黃酮提取液的制備 稱取苦蕎麥粉1.0g(精確到0.001g)于50mL三角瓶中，加入30mL 80%甲醇，60℃進(jìn)行超聲提取30min，趁熱減壓抽濾，定容，取1mL濾液，用微孔濾膜(0.2μm)過濾。

由于樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚含量不同，測定時將黃酮提取液分別稀釋為10000、100、10倍，用于測定蘆丁、槲皮素和山萘酚。

1.2.2 分析條件

1.2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(2.1×50mm，粒徑1.8μm);流動相甲醇(A)－水(0.1%甲酸)(B)梯度洗脫(見表1);柱溫35℃;流速0.6mL/min;樣品進(jìn)樣量10μL。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 儀器采用負(fù)離子接口模式，毛細(xì)管電壓2.0kV;離子源溫度150℃;錐孔反吹氣流量30L/h;脫溶劑氣溫度500℃;脫溶劑氣流量1000L/h。應(yīng)用Xevo TQ的IntelliStart技術(shù)建立相應(yīng)的質(zhì)譜方法(MRM)，分別進(jìn)每個標(biāo)準(zhǔn)品選擇最優(yōu)條件。母離子和子離子的質(zhì)量數(shù)和碰撞能量參數(shù)詳見表2。

表2 質(zhì)量條件參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的選擇

應(yīng)用ACQUITY UPLC HSS C18柱，以甲醇－0.1%甲酸水溶液為流動相，流速0.60mL/min，每一次進(jìn)樣的分析時間為3.0min，蘆丁、槲皮素、山萘酚出峰時間分別為1.19、1.68、1.83min。

蘆丁 (C15H30O16)分子量為 610.52，槲皮素(C15H10O7)分子量為302.24，山萘酚(C15H10O6)分子量為286.24，其在ESI負(fù)離子模式下均具有較強(qiáng)的離子化效率，m/z 609.06、m/z 301.95、m/z 285.02分別是其準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－。對其進(jìn)行子離子掃描得到碎片離子峰，分別選擇豐度較高的兩個特征離子m/z 300.15和271、m/z 150.91和178.98、m/z 187.45和92.85，對0.5ng/mL蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行同時定性定量檢測，其總離子流和定量離子流MRM圖見圖1。

圖1 蘆丁、槲皮素、山萘酚的MRM圖

2.2 方法的線性關(guān)系考察

將配制好的蘆丁、槲皮素、山萘酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為0.1、1、10、50、100μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10μL，以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，回歸方程分別為 Y=867.136X+57.0508，Y=132.72X+104.713，Y=1737.43X+11043.5。結(jié)果表明，在0.1～100μg/mL范圍內(nèi)，三種標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.999、0.990，線形關(guān)系如圖2～圖4。

圖2 蘆丁線性關(guān)系圖

圖3 槲皮素線性關(guān)系圖

圖4 山萘酚線性關(guān)系圖

2.3 方法的檢測限

實(shí)驗(yàn)確定蘆丁檢測限為 0.01ng/mL(S/N=25.90)，槲皮素檢測限為0.1ng/mL(S/N=22.49)，山萘酚檢測限為0.1ng/mL(S/N=61.30)。

2.4 方法的精密度

對同一黃酮提取液分別進(jìn)行6次進(jìn)樣測定，其結(jié)果如表3所示。

表3 方法的精密度測定結(jié)果

從表3中可以看出，該方法的精密度很好。

2.5 方法的重復(fù)性

對苦蕎麥樣品按照1.2.1.3方法制備黃酮提取液5份，分別進(jìn)樣測定蘆丁、槲皮素和山萘酚含量，結(jié)果如表4。

表4 重復(fù)性測定結(jié)果

表中結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

2.6 回收率

以苦蕎麥樣品作為基質(zhì)，分別對蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行低、中、高三個水平添加回收實(shí)驗(yàn)，每個水平重復(fù)測定5次，各添加回收水平、平均回收率與精密度見表5。

表5 添加回收率結(jié)果(n=5)

2.7 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法對11個苦蕎麥品種進(jìn)行蘆丁、槲皮素、山萘酚含量的測定，測定結(jié)果見表6。

表6 樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚含量測定結(jié)果

環(huán)境因素對苦蕎生物黃酮類物質(zhì)含量有著十分重要的影響，這些環(huán)境因素主要包括海拔、光照、土壤、氣候等，是形成不同品種苦蕎生物類黃酮物質(zhì)含量差異的重要因素［7－8］。測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜測定的數(shù)值較接近，表明超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法能用來對苦蕎麥中的蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行含量測定。相對于HPLC法，具有更短的分析時間和更高的檢測靈敏度。

3 結(jié)論

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚含量，具有前處理方法簡單、分析時間短、回收率穩(wěn)定的特點(diǎn)，且電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的MRM掃描方式抗干擾強(qiáng)，使方法的靈敏度更高，選擇性強(qiáng)，適用于同時進(jìn)行定性定量快速測定苦蕎麥中蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量。

［1］唐宇，王安虎.苦蕎的成分功能研究與開發(fā)應(yīng)用［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(4):355－358.

［2］張振福，羅文森.苦蕎麥的化學(xué)成分與特殊功能［J］.糧食與飼料工業(yè)，1998(2):40－41.

［3］Jianya Q，Dietmar M，Manfred K，et al.Flavonoids in fine buckwheat(Fagopyrum esculentum Mǒnch)flour and their free radicalscavenging activities［J］.Deutsche Lebensmittel－Rundschau，1999，95(9):343－349.

［4］Si－quanLi，et al.Advances in the development of functional foods from buckwheat［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2001，41(6):451－464.

［5］Mitsure W，et al.Antioxidant compounds from buckwheat(Fagopyrum esculentum Mǒnch)hulls［J］.Agric Food Chem，1997，45:1039－1044.

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［7］唐宇，趙剛.蕎麥中黃酮含量的研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(4):353－354.

［8］張瑞，楊楠，等.苦蕎核心種質(zhì)蘆丁含量測定及成因分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(4):157－161.

Determination of flavonoids in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS

LI Xin，WANG Bu－jun*
(Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences/The Cereal Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China)

The objective of this research was to establish a method for detecting Rutin，Quercetin and Kaempferol in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS.Tartary buckwheat samples were extracted with methanol in a ultrasonic cleaner，and Rutin，Quercetin and Kaempferol were separated by a HSS C18UPLC column，with methanol－0.1%formic acid as mobile phase，electrospray ionization was applied and operated in the negative ion mode，then quantified with multiple reaction monitoring(MRM).Results:Good linearities were observed in the range from 0.1～100μg/mL，with correlation coefficients above 0.99.The mean recoveries of three levels were all above 94%and the relative standard derivations were between 2.19 and 12.54.The detection limit of Rutin，Quercetin and Kaempferol were 0.01，0.1，0.1ng/mL，respectively.

tartary buckwheat;UPLC－MS－MS;flavonoids

TS211.7

A

1002－0306(2011)04－0383－04

2010－03－30 *通訊聯(lián)系人

李欣(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)。