余弦，王書林，林海霞，孫翠萍，王硯

DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛運(yùn)用于中藥的鑒定，高質(zhì)量的DNA模板是進(jìn)行PCR的重要前提，則DNA的提取是關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)在對(duì)中藥DNA的提取主要利用新鮮植株進(jìn)行提取，但從干燥藥材中提取DNA的研究較少，因?yàn)橹兴幉脑谄涓稍铩⒓庸?、貯藏等過(guò)程會(huì)造成DNA不同程度的降解。因此，如何從中藥材中提取高質(zhì)量的DNA模板是我們必須解決的問(wèn)題。本課題在改良的CTAB法基礎(chǔ)上對(duì)味連新鮮植株與干燥藥材基因組總DNA提取方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及預(yù)處理

干燥藥材均打成細(xì)粉。一部分味連植株新鮮葉片(1、5、9、13、17、21 號(hào))用 dd H2O 清洗后經(jīng)液氮急速冷凍，再轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存;另一部分新鮮葉片(2、6、10、14、18、22 號(hào))經(jīng) dd H2O 清洗后，擦干，剪成碎片，置于裝有干燥變色硅膠的密封袋里，充分搖勻，使之迅速干燥，放于干燥器中保存。實(shí)驗(yàn)材料采集地點(diǎn)及編號(hào)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料采集地點(diǎn)及編號(hào)

高廟鎮(zhèn)七里村 21～22號(hào) 23～24號(hào)洪雅 —— 25～26號(hào)重慶石柱 —— 27～28號(hào)

1.2 儀器

1.5 mL、2 mL離心管、研缽、Eppendorf精密移液器、Eppendorf centrifu ge 5417R高速冷凍離心機(jī)、電泳裝置、核酸－蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)、島津紫外分光光度儀、Innova U101超低溫冰箱、UPT超純水器、磁力攪拌器、高精度低溫恒溫槽、pH計(jì)、通風(fēng)櫥等。

1.3 試劑

2×CTAB 提取緩沖液［2%CTAB，100 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，20 mmol·L－1EDTA，1.4 mol·L－1NaCl，2%巰基乙醇］、TE 緩沖液［10 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、5×TBE 緩沖液(pH8.3)［445 mmol·L－1Tris 堿，445 mmol·L－1硼酸鹽，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、6×凝膠上樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油)、1.5%瓊脂糖凝膠(瓊脂糖1.5 g加至100 mL 0.5×TBE緩沖液中，加熱溶解備用)、Mass RulerTMDNA Ladder Mix、溴化乙錠、氯仿、異戊醇、醋酸鈉、無(wú)水乙醇、70%乙醇、dd H2O、液氮等。

1.4 方法

1.4.1 基因組總DNA的提?。?～3］

在2 mL離心管中加入65℃預(yù)熱的500 μL CTAB提取緩沖液;味連葉片用液氮研磨成細(xì)粉后(約1 g)加入離心管中，或味連干燥藥材細(xì)粉(約1 g)直接加入離心管中，小心混勻，于65℃水浴2 h，其間小心倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次;冷卻至室溫后，加入500 μL氯仿－異戊醇(24:1)抽提，靜置20 min分相，于10000 g 4℃離心10 min后取上清液;加入1/10體積3M NaAc(pH5.2)和2倍體積－20℃無(wú)水乙醇，－20℃過(guò)夜;用毛細(xì)管加熱制成帶“U”形鉤狀玻棒，將沉淀?yè)瞥?沉淀用1.5 mL 70%乙醇洗兩次，4000 g短暫離心，傾去乙醇，沉淀室溫晾干，溶于200 μL TE(pH8.0)緩沖液中，保存于－20℃。

1.4.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

取DNA溶液稀釋50倍，以TE溶液為空白溶液，用紫外分光光度法測(cè)定DNA在260 nm及280 nm處的吸光值，然后根據(jù)OD260/OD280比值判斷DNA純度，并根據(jù)DNA 260 nm檢測(cè)其濃度。根據(jù)公式計(jì)算DNA樣品的濃度:雙鏈DNA溶液濃度(μg/μL)=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

DNA樣品中加入1/5體積的6×凝膠上樣緩沖液，混勻后取8 μL樣品在1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5μL·mL－1的EB溶液染色)中進(jìn)行電泳分離，同時(shí)要設(shè)立合適相對(duì)分子質(zhì)量的DNA marker(Mass RulerTMDNA Ladder Mix)，以5 V/cm膠的電壓電泳3 h。在凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)DNA的純度及降解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取結(jié)果

在加入－20℃無(wú)水乙醇以后便出現(xiàn)白色絮狀DNA沉淀，－20℃靜置過(guò)夜后有利于沉淀。新鮮植株提取的DNA溶液無(wú)色透明，而干燥藥材粉末提取的DNA溶液呈淡黃色，可能是由于藥材中的小檗堿等成分溶出造成。

2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

如DNA樣品的OD260/OD280比值大于1.8，說(shuō)明仍存在RNA;OD260/OD280比值小于1.6，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚。對(duì)味連提取的基因組總DNA進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果見表2，表3。

表2 味連新鮮葉片DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

表3 味連干燥藥材DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

由表2、表3可見，測(cè)得各樣品溶液OD260/OD280的比值在1.6～1.8之間，說(shuō)明 DNA純度較高;根據(jù)DNA在260nm處測(cè)得的吸光值所計(jì)算出的DNA濃度也較高。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳后在100 bp處均呈現(xiàn)一條條帶，說(shuō)明從味連新鮮植株及干燥藥材中均提出了DNA。比較圖1A、B中條帶的亮度及清晰度，可見從新鮮植株中提取的DNA條帶亮度比從干燥藥材中提取的亮，表示從新鮮植株中提取的DNA濃度較高;且個(gè)別干燥藥材DNA(3、4、7號(hào))的條帶有暈染，揭示DNA有一定程度的降解。

圖1 味連基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討論

此方法能從味連新鮮植株與干燥藥材中提取DNA，這就擴(kuò)大了中藥DNA的提取來(lái)源。從新鮮植株中提取的DNA濃度與純度比干燥藥材中提取的要高;從干燥藥材中提取的DNA有一定程度的降解。但從味連干燥藥材中提取的DNA能否滿足PCR及后續(xù)擴(kuò)增條件，有待于下一步研究。

［1］ 黃璐琦．分子生藥學(xué)［M］．北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006．

［2］ 李曉波，馮波，張朝輝，等．植物藥材總DNA提取［J］．中草藥，2002，33(7):652．

［3］ 曹琳，劉忠權(quán)，郝明干，等．不同種類中藥材的DNA提取方法［J］．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2004，21(6):465．