周劍平，任宇紅，張敏潔，孫曉鋒，魏東芝

華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

畢赤酵母不對稱合成阿托伐他汀中間體

周劍平，任宇紅，張敏潔，孫曉鋒，魏東芝

華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

阿托伐他汀可通過抑制 HMG-CoA還原酶與底物的結合來抑制膽固醇的合成，而 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯是阿托伐他汀合成的重要中間體。通過對實驗室保藏菌種進行篩選，得到一株巴氏畢赤酵母X-33可將5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯還原為 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯。在磷酸鹽緩沖液體系中考察了初始底物濃度、反應時間、輔助底物、葡萄糖添加量、pH、溫度等因素對產(chǎn)物收率和對映體選擇性的影響，獲得了較佳的反應條件。選擇底物投料量為7 g/L時，當菌體濃度120 g/L，葡萄糖添加量120 g/L，pH 6.5，溫度35 ℃，反應時間12 h，產(chǎn)物 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的收率可達到93.12%，對映體過量值可達到98.55%。

畢赤酵母，不對稱還原，5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯，(R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯

Abstract:Ethyl (R)-3-hydroxy-5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-pentanoate is a potential intermediate for the synthesis of HMG-CoA reductase inhibitor (atorvastatin) that can lower the cholesterol level in human blood. In this study, in order to synthesize ethyl (R)-3-hydroxy-5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-pentanoate by bioreduction, the yeast strains in our lab were screened. Ethyl (R)-3-hydroxy-5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-pentanoate was found to be produced efficiently from ethyl 5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-oxopentanoate by Pichia pastoris X-33. The effects of initial substrate concentration, reaction time, co-substrate, amount of yeast cells, pH, as well as the temperature on the yield and enantiomeric excesses (e.e. value) of product were examined in mono-phase system. The optimal reaction conditions are as fallows: substrate concentration 7 g/L, cell concentration 120 g/L, glucose concentration 120 g/L, pH 6.5, temperature 35 °C, reaction time 12 h, and the yield 93.12% with the high e.e. value of 98.55%.

Keywords:Pichia pastoris X-33, asymmetric reduction, ethyl 5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-oxopentanoate, ethyl(R)-3-hydroxy-5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)- pentanoate

阿托伐他汀 (立普妥) 是目前世界上十分暢銷的調血脂藥物。該藥物是HMG-CoA還原酶的抑制劑，可通過抑制 HMG-CoA還原酶與底物的結合來抑制膽固醇的合成，同時，阿托伐他汀還可以降低低密度脂蛋白(LDL) 和甘油三酯(TG) 的濃度，升高高密度脂蛋白(HDL) 的濃度，從而對動脈粥樣硬化和冠心病的防治有重要意義[1-3]。阿托伐他汀的合成過程中，難點在于側鏈兩個手性羥基的合成，早期的研究均采用化學方法合成，不僅需要高成本的金屬催化劑，且反應條件激烈，需多步反應才能實現(xiàn)[4-5]。這就使生物催化法在合成藥物手性中間體方面顯示出了更大的吸引力和更佳的優(yōu)勢。生物催化法在制備手性化合物方面，具有效率高、條件溫和、成本低、步驟少、環(huán)境污染少、不需添加昂貴的輔酶、產(chǎn)物對映體過量值高等優(yōu)點，這給藥物制造工業(yè)帶來了新的發(fā)展前景[6]。

(R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯作為光學活性物質，是合成阿托伐他汀的重要中間體之一。本文利用從本實驗室保藏的菌株中篩選到的一株對映體選擇性較好的巴氏畢赤酵母X-33，在磷酸鹽緩沖液體系中對其轉化5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯的反應條件進行了研究。采用該方法得到的產(chǎn)物收率可達93%以上，能得到高光學純度的手性產(chǎn)物，且反應專一性強、副產(chǎn)物少、后處理簡單，具有很好的工業(yè)開發(fā)應用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

燕山面包酵母 Baker’s yeast 1購自河北馬利食品有限公司，馬利面包酵母 Baker’s yeast 2購自中澳合資哈爾濱馬利酵母有限公司，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae購自上海工業(yè)微生物研究所，巴氏畢赤酵母Pichia pastoris Gs115、巴氏畢赤酵母Pichia pastoris X-33購自美國Invitrogen公司。

5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯、(R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯購自浙江京新藥業(yè)公司，甲醇、正己烷、異丙醇 (均為 HPLC級) 購自TEDIA公司，其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司。

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂粉20 (固體)。

1.2 不對稱還原反應

還原反應過程如圖1所示。

圖 1 生物還原 5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯合成(R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯Fig. 1 Bioreduction of ethyl 5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-oxopentanoate to ethyl (R)-3-hydroxy-5-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-pentanoate.

酵母在搖瓶中 30 ℃、180 r/min培養(yǎng) 32 h，6 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，所得濕菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后用于轉化反應。

取適量濕菌體，懸浮于25 mL緩沖液中，加入適量 5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯和輔助底物，180 r/min下反應24 h。所有實驗均重復3次。

1.3 HPLC測定3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的濃度

將 1.2所得的反應液離心去菌體后，洗滌 2次后定容至50 mL。用Agilent 1100 series HPLC監(jiān)測系統(tǒng)測定產(chǎn)物3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的收率，色譜柱為 XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相：甲醇/水 (體積比為：50/50)，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，波長：219 nm。底物和產(chǎn)物結構經(jīng)質譜、HNMR及旋光度檢測確定。

1.4 HPLC測定 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的對映體過量值(e.e.值)

反應液處理過程如下：將反應液上清用等體積的乙酸乙酯進行萃取，萃取液于 40 ℃水浴旋轉蒸發(fā)，得到淡黃色油狀液體，配制成溶液 (以異丙醇做溶劑)。用Agilent 1100 series HPLC監(jiān)測系統(tǒng)測定產(chǎn)物 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的e.e.值，色譜柱為Chiralcel OD-H (4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相：正己烷/異丙醇 (體積比為：90/10)，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，波長：219 nm。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

產(chǎn)羰基還原酶的微生物主要以酵母居多，對本實驗室保藏的各類酵母進行初篩和復篩，得到一株產(chǎn)羰基還原酶的巴氏畢赤酵母X-33，復篩結果如表1。以搖瓶發(fā)酵得到的菌體為酶源，畢赤酵母 X-33產(chǎn)酶較穩(wěn)定，產(chǎn)物收率較高，立體選擇性較好。綜合考慮，本實驗選擇該菌株作為催化菌株。

表1 菌種復篩結果Table 1 Multiple isolation of the strains

2.2 底物濃度對反應的影響

由圖 2可知，隨著底物濃度的增加，產(chǎn)物的收率逐漸降低，這可能是由于存在底物抑制或者產(chǎn)物抑制，也有可能是底物和產(chǎn)物在緩沖液中的溶解性不佳所致。底物濃度對e.e.值的影響不大。

圖2 底物濃度對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Fig. 2 Effect of substrate concentration on yield and enantiomeric excesses of product.

2.3 時間對還原反應時間的影響

如圖3所示，隨著反應時間的增加，產(chǎn)物收率逐步提高，反應前12 h是產(chǎn)物迅速合成階段，收率達到 86.79%。但隨著反應時間的延長，超過 12 h后，產(chǎn)物的積累、底物濃度的降低以及部分酶的失活等眾多因素的影響使得反應速度逐漸下降，收率基本不再變化。反應時間對e.e.值影響不大。根據(jù)產(chǎn)物的收率和e.e.值確定12 h為較佳反應時間。

圖3 反應時間對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Fig. 3 Effect of reaction time on yield and enantiomeric excesses of product.

2.4 菌體濃度對反應的影響

菌體濃度在一定程度上代表著反應體系中酶的濃度，因此菌體濃度的增加，有助于加快反應速度，但是菌體濃度增加的同時也增加了成本。因此有必要尋求一個處于收率和菌體量之間的最佳配比。

圖4 菌體濃度對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Fig. 4 Effect of yeast concentration on yield and enantiomeric excesses of product.

由圖 4可知，隨著菌體濃度的增加，產(chǎn)物的收率逐步提高；當菌體濃度達到120 g/L之后，產(chǎn)物收率達較高水平，且基本維持穩(wěn)定，可能是底物已消耗完或者一部分底物被分解。菌體濃度對e.e.值影響不大，e.e.值一直維持在98%左右。所以綜合考慮，我們選擇120 g/L作為最佳菌體濃度。

2.5 輔助底物對反應的影響

催化5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯還原為(R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯不僅需要羰基還原酶，細胞內的一些脫氫酶也起著重要的作用，可氧化一些輔助底物，促進 NADPH的再生，持續(xù)不斷的提供還原反應所需的氫。常見的脫氫酶有葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶和醇脫氫酶等[7]，所以有必要對輔助底物進行篩選，結果見表2。

表2 輔助底物對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Table 2 Effect of co-substrates on yield and enantiomeric excesses of product

各類輔助底物的添加量為120 g/L。由表2可知，不同的輔助底物會不同程度地影響產(chǎn)物的收率和e.e.值。無輔助底物時，酵母細胞只能利用自身的糖原進行輔酶再生，但是自身產(chǎn)生的輔酶NAD(P)H的量是有限的，且不能進行循環(huán)再生，所以反應的收率很低，僅達 16.54%，且對映體選擇性較低，為81.65%。以蔗糖或者異丙醇為輔助底物時，反而會降低產(chǎn)物的收率，可能是其對細胞產(chǎn)生了毒害作用。甘油、甲醇和葡萄糖作為輔助底物時可增加產(chǎn)物的收率，提高反應的立體選擇性。其中又以葡萄糖作為輔助底物時效果最佳，產(chǎn)物收率和e.e.值均最高。

2.6 葡萄糖添加量對反應的影響

考察了不同的葡萄糖濃度對反應的影響。從圖5可以看出，當葡萄糖濃度低于120 g/L時，產(chǎn)物的收率隨著葡萄糖濃度的增加而提高。繼續(xù)增加葡萄糖的濃度，產(chǎn)率卻有所下降，可能是高濃度的葡萄糖對菌體的生長不利，或者影響了羰基還原酶的活性。葡萄糖添加量對產(chǎn)物的e.e.值影響不大。

圖5 葡萄糖濃度對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Fig. 5 Effect of glucose concentration on yield and enantiomeric excesses of product.

2.7 pH對反應的影響

配制不同pH的磷酸鹽緩沖液，考察pH對還原反應的影響，結果如圖6所示。在酸性條件下，產(chǎn)物收率隨著pH的升高而增加，當pH達到6.5時，收率最高，隨著pH值的繼續(xù)提高，產(chǎn)物收率則略微下降。pH對產(chǎn)物的e.e.值影響不大。

2.8 溫度對反應的影響

圖6 pH對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Fig. 6 Effect of pH on yield and enantiomeric excesses of product.

考察了不同反應溫度對產(chǎn)物收率和 e.e.值的影響。酶只有在一定的溫度下才能保持最佳的催化活性。低溫下酶的活性較低，但高溫也會導致酶的失活。表 3顯示了隨著溫度的升高，產(chǎn)物的收率逐漸提高，當溫度為 35 ℃時收率最高，再升高溫度收率則明顯下降，這可能是由于酶的變性失活。產(chǎn)物的e.e.值隨溫度的升高略有降低，但影響不大。

表3 反應溫度對產(chǎn)物收率和e.e.值的影響Table 3 Effect of reaction temperature on yield and enantioneric excesses of product

3 結論

對實驗室保藏的菌種進行篩選得到一株巴氏畢赤酵母X-33，可將5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯不對稱還原為 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯。對催化反應的條件進行了研究，并確定了最佳的反應條件：選擇底物投料量為7 g/L，菌體濃度為120 g/L，葡萄糖添加量為120 g/L，pH為6.5，溫度為 35 ℃。在以上條件下，產(chǎn)物 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的收率最高可達到93.12%，對映體過量值可達到 98.55%。在不對稱還原5-鄰苯二甲酰亞胺-3-氧代戊酸乙酯為 (R)-3-羥基-5-鄰苯二甲酰亞胺基戊酸乙酯的反應中，巴氏畢赤酵母X-33表現(xiàn)出非常好的立體選擇性，且e.e.值基本不受環(huán)境因素的影響，可進一步深入研究。

REFERENCES

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Asymmetric synthesis of atorvastatin intermediate by Pichia pastoris X-33

Jianping Zhou, Yuhong Ren, Minjie Zhang, Xiaofeng Sun, and Dongzhi Wei
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science & Technology, Shanghai 200237, China

Received: May 31, 2010; Accepted: August 18, 2010

Supported by: Key Project of the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2008BAI63B07).Corresponding author: Yuhong Ren. Tel: +86-21-64252163; E-mail: yhren@ecust.edu.cn

“十一五”國家科技支撐計劃 (No. 2008BAI63B07) 資助。