馬金柱，崔玉東,，張晶，朱戰(zhàn)波，樸范澤

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科技學院，大慶 163319

2 黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319

金黃色葡萄球菌isdb基因的克隆表達及其小鼠免疫試驗

馬金柱1，崔玉東1,2，張晶1，朱戰(zhàn)波2，樸范澤2

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科技學院，大慶 163319

2 黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319

為了研究金黃色葡萄球菌表面Isdb蛋白的免疫原性，應用PCR方法擴增出金黃色葡萄球菌Wood46株的isdb基因并進行序列分析，再將isdb 基因插入到pET32-a(+) 載體上，構建了pET32-a(+)-isdb重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉化到宿主菌大腸桿菌BL21中并誘導表達和純化Isdb蛋白。用純化的Isdb蛋白免疫小鼠，檢測小鼠血清中抗體水平；在二次免疫之后的第2周，用金黃色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1株對小鼠攻毒，每組8只小鼠。研究結果發(fā)現(xiàn)：isdb基因在不同菌株中高度保守；Isdb蛋白在宿主菌中獲得成功表達；在免疫后血清抗體效價與對照組相比，均顯著升高 (P＜0.05)；攻毒結果表明Isdb蛋白對Wood46和HLJ23-1兩種菌株攻毒保護率分別為62.5%和75%。以上結果表明Isdb蛋白具有較好的免疫原性和免疫保護作用。

金黃色葡萄球菌，isdb基因克隆，Isdb蛋白表達，免疫原性

Abstract:In order to characterize the immunogenicity and immunoprotection of the Staphylococcus aureus (S. aureus) surface Isdb, we amplified isdb gene from S. aureus Wood46 strain. The isdb gene was subsequently inserted into pET32a(+) vector and the recombinant plasmid was transformed into E. coli strain BL21. The recombinant Isdb was expressed and purified. Then, we immunized mice with the purified recombinant protein. The antibody level was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Finally, immunized mice were challenged with S. aureus strains Wood46 and HLJ23-1. These results showed that isdb gene sequences were highly conserved, and the recombinant Isdb was successfully expressed. The antibody titer in the immunized groups was increased significantly (P<0.05) compared with the control, the protective rate of Isdb protein inducted by challenge with the two S. aureus stains Wood46 and HLJ23-1 was 62.5% and 75%, respectively. These results showed that the Isdb protein had high immunogenicity and immunoprotective capacity.

Keywords:Staphylococcus aureus, isdb gene cloning, Isdb expression, immunogenicity

金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus是一種重要的致病菌，可以引起人和動物的多種疾病，尤其它是引起奶牛乳房炎的主要病原菌，給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。目前，抗生素和金黃色葡萄球菌全菌苗、類毒素等傳統(tǒng)疫苗是臨床上預防和治療奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎的主要方法，但是抗生素的耐藥性、藥物殘留和傳統(tǒng)疫苗免疫原性低等問題，一直以來都是亟待解決的重要難題[4-6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)菌體表面蛋白疫苗要比傳統(tǒng)疫苗具有許多優(yōu)點。它可引起機體產(chǎn)生較強的免疫應答，并且免疫持續(xù)時間長，同時它還可解決抗原血清型限制性等問題，這些優(yōu)點使菌體表面蛋白可以作為新型疫苗。為了研究金黃色葡萄球菌菌體表面 Isdb蛋白的免疫原性，本研究通過基因工程方法表達Isdb蛋白，并將純化的表達蛋白免疫小鼠，研究該蛋白的免疫原性，為進一步研制和開發(fā)金黃色葡萄球菌新型疫苗提供了有利參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒：金黃色葡萄球菌標準菌株Wood46(S. aureus Wood46) 和地方分離菌株HLJ23-1(S. aureus HLJ23-1)、E. coli BL21宿主菌、原核表達載體pET32a(+) 均由黑龍江省八一農(nóng)墾大學生物工程實驗室提供。

主要試劑及酶：質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶 Nco I/Xho I、Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、蛋白marker、MagneHis?蛋白純化系統(tǒng)、HRP標記的羊抗鼠抗體均購自大連寶生物工程有限公司；細胞因子 ELISA定量檢測試劑盒購自 BPB Biomedical公司。

實驗動物：昆明潔凈級小鼠，體重約10~15 g，由長春市養(yǎng)殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建

引物設計：根據(jù)GenBank中的isdb基因序列，利用DNAStar軟件設計1對擴增isdb編碼全基因的特異性引物，并且引物兩端分別加上酶切位點Nco I和Xho I的堿基序列 (下劃線所示)，經(jīng)分析后引物具有很好的特異性。引物序列見表 1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 融合基因引物Table 1 Primers for fusion gene

isdb編碼基因的獲得：采用蛋白酶方法提取金黃色葡萄球菌Wood46株的基因組DNA，并將其作為模板進行 PCR擴增。PCR反應體系組成如下：去離子水 14.3 μL，上游引物 1 μL (25 μmol/L)和下游引物 1 μL (25 μmol/L)，DNA 模板 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10×PCR 緩沖液 2 μL，10 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，總反應體系為20 μL。PCR反應條件為：94 ℃預熱3 min；94 ℃40 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min ，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后，取3 μL產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

酶切與連接及轉化：將純化的 PCR產(chǎn)物和pET32a(+) 載體酶切，酶切體系包括：10×NEB緩沖溶液 5 μL，PCR 產(chǎn)物 8 μL，100×BSA 0.5 μL，Nco I 1 μL，Xho I 1 μL，ddH2O 34.5 μL，混勻后，37 ℃水浴中酶切4 h。再將純化的酶切產(chǎn)物進行連接，連接體系為：Solution I 5 μL (含 T4 DNA 連接酶)，PCR產(chǎn)物 4 μL，載體 11 μL，最后 16 ℃連接 6 h。將上述連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中按熱休克方法進行轉化。

表達載體的鑒定：上述轉化的菌培養(yǎng)12 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。采用酶切和測序分析的方法對提取的重組質(zhì)粒進行鑒定，將獲得正確的重組質(zhì)粒命名為 pET32a(+)-isdb，從而獲得 isdb原核表達載體。

1.2.2 重組Isdb蛋白的誘導表達及純化

將構建的重組菌50 μL接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4時，加入IPTG誘導表達4 h后，取1 mL菌液，10 000 r/min離心，棄上清，在沉淀中加入90 μL 1×上樣緩沖液和 10 μL DTT (1 mmol/L) 后，煮沸5 min，取15 μL用于SDS-PAGE，同時，以未誘導重組菌和誘導的 pET32a(+) 空載體的重組菌為對照。另外，采用鎳顆粒蛋白純化試劑盒進行蛋白純化，然后取10 μL蛋白濃縮液用于SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化效果。

1.2.3 動物免疫

取健康小鼠62只，隨機分成2組，每組31只，分別為對照組和Isdb蛋白免疫組。首免時對照組和蛋白免疫組每只小鼠分別用200 μL弗氏完全佐劑和與PBS乳化物 (體積比1∶1) 和200 μL Isdb蛋白免疫原 (含有100 μg Isdb蛋白PBS溶液與弗氏完全佐劑等體積乳化制成) 免疫。首疫后第21天進行2次免疫，對照組每只小鼠采用200 μL弗氏不完全佐劑與PBS乳化物 (體積比1∶1) 免疫，蛋白免疫組用200 μL Isdb 蛋白免疫原 (含有 100 μg Isdb 蛋白 PBS溶液與弗氏不完全佐劑等體積乳化制成) 免疫，免疫途徑均為背部多點注射。在一免后7 d、14 d、21 d及二免后7 d、14 d進行采血，每次每組隨機取3只小鼠采血，分離血清，用于抗體水平檢測，每組剩16只小鼠用于攻毒試驗。

1.2.4 重組Isdb蛋白的免疫原性檢測

重組Isdb蛋白的Western blotting檢測：將未經(jīng)誘導和IPTG誘導4 h的樣品進行SDS-PAGE。按半干轉印法將膠中的蛋白質(zhì)轉移至 Nitrocellulose膜上，用金黃色葡萄球菌全菌體疫苗免疫二免 2周后的稀釋1 000倍小鼠血清為一抗；HRP標記的羊抗小鼠為二抗，用立春紅顯色法顯色，進行重組蛋白的Western blotting檢測。

水平的測定：將作適當稀釋的Isdb純化蛋白以100 μL/孔(60 ng) 包被 ELISA 板，4 ℃過夜；PBST洗滌后加封閉液37 ℃封閉1 h；PBST洗滌，加入用5%脫脂奶粉稀釋的待檢免疫血清，37 ℃作用1 h；PBST洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1 ∶ 1 0 000)，37 ℃作用1 h；PBST洗滌后，每孔各加入TMB 100 μL溶液，避光37 ℃作用10 min；加50 μL終止液；最后測樣品OD值并分析。

小鼠攻毒試驗：取 50 μL ?20 ℃凍存的 S. aureus Wood46 (Ⅴ型莢膜) 和S. aureus HLJ23-1 (Ⅷ型莢膜) 菌液接種到5 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)復壯后，按平板計數(shù)法測定菌數(shù)，取對數(shù)生長期的細菌用PBS 洗滌3次后，根據(jù)測定以上兩種菌對小鼠的最小致死量分別為3×109CFU和1×109CFU，最終將兩種菌終濃度分別定為 1.5×1010CFU/mL和5×109CFU/mL。用兩種菌分別對二免2周的Isdb蛋白免疫組和對照組各 8只小鼠攻毒，每只腹腔注射菌液0.2 mL，攻毒后，每天觀察小鼠死亡情況并記錄結果。

2 結果

2.1 isdb基因PCR擴增結果

以提取的金黃色葡萄球菌Wood46菌株DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到一條特異DNA條帶，與預期片段大小 (1 893 bp) 相符，電泳結果如圖1所示。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結果

圖1 isdb基因的PCR產(chǎn)物Fig. 1 PCR products of isdb. 1: PCR products; 2: DNA marker.

圖2 pET32a(+)-isdb的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pET32a(+)-isdb by enzyme digestion.1: DNA marker; 2: pET32a(+)-isdb Digested with Nco I and Xho I.

pET32a(+)-isdb質(zhì)粒采用Nco I與Xho I雙酶切后，經(jīng)過瓊脂糖電泳，可見插入的片段與目的片段大小相符，酶切后得到約為1 900 bp和5 900 bp的兩條帶，如圖2所示。目的基因測序結果與GenBank上 4種標準菌株 (Staphylococcus aureus MW2，Staphylococcus aureus COL，Staphylococcus aureus N315，Staphylococcus aureus NEMAN) 的核酸和氨基酸之間比較同源性均為98.5%以上 (圖3、4)，說明不同菌株間isdb具有較高的同源性。以上結果表明目的基因插入正確。

2.3 重組菌的表達結果

重組菌誘導表達后進行SDS-PAGE電泳，結果在大于87 kDa位置出現(xiàn)1條明顯的條帶，與預測的重組蛋白Isdb (87.3 kDa) 大小相符 (圖5)。

2.4 Isdb蛋白的Western blotting檢測結果

應用S. aureus全菌免疫小鼠的血清為一抗體，測定重組蛋白的免疫原性，結果顯示在87 kDa位置出現(xiàn)特異性條帶，說明重組蛋白Isdb能與免疫血清發(fā)生反應并具有好的免疫原性 (圖6)。

2.5 重組蛋白的免疫效果檢測

2.5.1 IgG水平的測定結果

將每份一免小鼠血清1:1 000倍稀釋后，再做2倍倍比稀釋 (每組3只小鼠血清)，即做1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000、1:32 000、1:64 000倍稀釋。二免小鼠以1:4 000、1:8 000、1:16 000、1:32 000、1:64 000、1:128 000、1:256 000、1:512 000倍稀釋，以羊抗鼠IgG為二抗做間接ELISA檢測血清中IgG。結果小鼠免疫后Isdb抗體效價有明顯提高，并隨著免疫時間推移，抗體效價逐漸上升，并在二免2周時抗體效價達到高峰 (表2)。

圖3 核酸序列的比較Fig. 3 Comparison of nucleic acid sequence.

圖4 氨基酸序列的比較Fig. 4 Comparison of amino acid sequence.

圖5 重組菌誘導表達結果Fig. 5 Expression of induced recombinant E. coli. M: protein marker; 1: uninduced recombinant E. coli (pET32a(+)-isdb); 2:induced recombinant E. coli (pET32a(+)-isdb); 3: induced recombinant E. coli (pET32a(+); 4: uninduced recombinant E. coli (pET32a(+)).

圖6 Isdb蛋白的Western blotting結果Fig. 6 Western blotting analysis of Isdb protein. 1: induced recombinant E. coli (pET32a(+)-isdb); 2: purified Isdb protein;3: protein marker.

2.5.2 攻毒實驗結果

各免疫組在二免2周后，每組隨機選出8只小鼠分別用S. aureus Wood46和S. aureus HLJ 23-1菌株攻毒，攻毒后 1周內(nèi)觀察小鼠的死亡情況。結果表明：S. aureus Wood46株攻毒組中，對照組小鼠全部死亡時，Isdb蛋白免疫組的保護率為 62.5%；S. aureus HLJ 23-1株攻毒組中，對照組小鼠全部死亡時，Isdb蛋白免疫組的保護率為 75%，如表3所示。

3 討論

目前，金黃色葡萄球菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)給臨床上疾病的預防和治療帶來了巨大的困難，這也使金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎解決的問題變得更加嚴峻。在過去的40多年里，人們對金黃色葡萄球菌全菌滅活苗、莢膜多糖結合苗以及菌體結構蛋白亞單位苗等作了大量研究，但免疫保護效果都不令人滿意。研究學者發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌表面蛋白具有很好的免疫原性，將是解決金黃色葡萄球菌性疾病一個新的研究方向[7]。Isdb是Sortase A錨定在金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白，它在金黃色葡萄球菌轉運宿主血紅蛋白過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。Kuklin等研究表明 Isdb具有高度的保守性，并且Isdb蛋白對獼猴均有良好的免疫原性[10]，但是，目前Isdb蛋白對其他動物的免疫原性的研究較少。

本研究表明Isdb蛋白能夠刺激小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫，并且對 S. aureus Wood46和 S. aureus HLJ23-1兩種不同的菌株攻毒保護率分別為 62.5%和75%，這種保護效果要比Gaudreau等研究的Clfa、FnBPA和Sortase酶 (Srt) 多蛋白的DNA疫苗的保護率高出10%左右[11]，與馮昊等研究的Clfa蛋白的保護率比較接近[12]，這進一步說明Isdb蛋白具有較好的免疫原性。Isdb蛋白不能完全起到保護作用的原因可能與金黃色葡萄球菌的致病因子的多樣性有關，也與金黃色葡萄球菌能通過莢膜阻止吞噬細胞的調(diào)理作用和產(chǎn)生多種免疫逃避因子以使自身逃避宿主免疫反應有直接關系[13]，所以，要想解決金黃色葡萄球菌的感染問題，還需要進一步提高Isdb蛋白的保護率。隨著對這種病原菌認識的不斷深入和對金黃色葡萄球菌疫苗的研究探索，有學者提出預防金黃色葡萄球菌感染需要使用多抗原成分疫苗有望提高疫苗的保護率[14-15]，這樣不同蛋白聯(lián)合免疫可以一定程度上提高其免疫效果[16]，至少不應該比單一抗原免疫保護效果差[17]。所以，Isdb蛋白與金黃色葡萄球菌表面其他的結構蛋白組成聯(lián)合疫苗有可能提高其免疫效果。另外，以上兩種菌保護率的差異可能是兩種菌不同莢膜型對抗吞噬作用影響程度的不同所致，也有可能是細菌本身毒力差異不同所致。要想澄清以上兩種菌株保護率差異的問題還需要進一步深入研究。本研究為臨床預防和治療奶牛乳房炎疾病提供了有利參考，也為解決人的金黃色葡萄球菌性疾病提供了很好借鑒。

表2 免疫鼠血清中Isdb的IgG抗體效價Table 2 Antibody titer of IgG in the sera of the immunized and control mice

表3 不同金黃色葡萄球菌菌株攻毒結果Table 3 Challenge of immunized mice with S. aureus strains

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Cloning and expression of Staphylococcus aureus surface protein Isdb and its immune experiment in mice

Jinzhu Ma1, Yudong Cui1,2, Jing Zhang1, Zhanbo Zhu2, and Fanze Piao2
1 College of Life Science and Biotechnology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China
2 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China

Received: August 31, 2010; Accepted: December 28, 2010

Corresponding author: Yudong Cui. Tel: +86-459-6819290; E-mail: cuiyudong@yahoo.com