林曉華，柯崇榕，吳畢莎，鄭永標(biāo)，李力，陳由強(qiáng)，黃建忠

1 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心 生命科學(xué)學(xué)院 福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福州 350108

2 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，福州 350108

釀酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的構(gòu)建

林曉華1*，柯崇榕1*，吳畢莎1，鄭永標(biāo)1，李力1，陳由強(qiáng)2，黃建忠1

1 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心 生命科學(xué)學(xué)院 福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福州 350108

2 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，福州 350108

構(gòu)建一株釀酒酵母 SNF4基因缺失菌株并研究其對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響。擴(kuò)增帶有 SNF4基因上下游同源序列和Kanr篩選標(biāo)記的SNF4基因敲除組件，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YS2獲得陽(yáng)性克隆子，然后將質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)到陽(yáng)性克隆子中，半乳糖誘導(dǎo)pSH65表達(dá)Cre酶切除Kanr篩選標(biāo)記，獲得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺失菌株YS2-△SNF4乙醇產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了7.57%。利用Cre-LoxP系統(tǒng)，成功構(gòu)建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇產(chǎn)生量。

釀酒酵母，SNF4，基因敲除

Abstract:Construction and ethanol production effects of SNF4 gene knockout in Saccharomyces cerevisiae were described in this paper. For knockout of SNF4 gene in S. cerevisiae YS2, a PCR-amplified disruption cassette was used, encoding the short flanking homologous regions to the SNF4 gene and Kanras selectable marker. The SNF4 gene disruption cassette was transformed into S. cerevisiae YS2 through LiAc/SS Carrier DNA/PEG. The positive transformants were grown on G418 plates and verified by PCR. The Kanrmarker was rescued by transforming plasmid pSH65 into positive transformants and inducing expression of Cre recombinase in galactose-containing medium. Lastly, the YS2-△SNF4 strain, in which SNF4 allele gene were completelyknocked out, was obtained by repeating the same procedure. The result of anaerobic fermentation showed that ethanol production of the SNF4 gene knockout strain had increased by 7.57 percent as compared with the original strain YS2. The experiment indicated ethanol production could be improved significantly with the approach of SNF4 gene knockout by Cre-LoxP system.

Keywords:Saccharomyces cerevisiae, SNF4, gene knockout

20世紀(jì) 80年代后，隨著能源危機(jī)的加劇，生物燃料乙醇作為一種可再生的能源，備受各個(gè)國(guó)家的關(guān)注，構(gòu)建高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株成為研究熱點(diǎn)。近幾年來(lái)，利用代謝工程技術(shù)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行遺傳改造，控制乙醇生物合成代謝流，降低乙醇分解，已成為構(gòu)建工程菌的重要方向之一[1]。參與乙醇代謝過(guò)程的乙醇脫氫酶系 (Adh1p-Adh5p)之一的 Adh2p是具有催化乙醇生成乙醛的功能[2]，產(chǎn)生葡萄糖阻遏效應(yīng)。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)環(huán)境中葡萄糖耗盡時(shí)，受葡萄糖阻遏的ADH2基因起始表達(dá)，從而利用乙醇作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量的降低[3-4]。

Snf1蛋白激酶復(fù)合體是屬于高保守的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶類家族，包括 Snf1p、Snf4p和Sip1p/Sip2p/Ga83p五個(gè)亞基，是受葡萄糖阻遏效應(yīng)的基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白[5-7]。其中Snf4p對(duì)具有調(diào)節(jié)Snf1蛋白激酶的活性具有重要的功能。當(dāng)環(huán)境中葡萄糖濃度高時(shí)，Snf1p自抑制使Snf1蛋白激酶處于非活性狀態(tài)；當(dāng)葡萄糖消耗殆盡時(shí)，Snf4p與其Snf1p催化區(qū)域相結(jié)合從而降低Snf1p的自抑制，激活 Snf1蛋白激酶活性，ADH2基因起始表達(dá)[8-10]。因此敲除SNF4基因，可以在降低ADH2基因的表達(dá)量，在一定程度上降低乙醇的利用率，提高乙醇產(chǎn)量。本研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)、Kanr抗性標(biāo)記和同源重組技術(shù)敲除SNF4基因，構(gòu)建釀酒酵母SNF4等位基因缺失菌株并提高了釀酒酵母YS2的乙醇產(chǎn)量7.57%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

釀酒酵母 YS2 (HIS3/URA3/LEU2/TRP1) 由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏，是一株工業(yè)乙醇生產(chǎn)菌株，原養(yǎng)型，雙倍體；質(zhì)粒pUG6、pSH65購(gòu)自德國(guó)EUROSCARF，其中pUG6攜帶 Kanr篩選標(biāo)記基因，兩端帶有 LoxP位點(diǎn)；pSH65攜帶Bler篩選標(biāo)記基因，在半乳糖的誘導(dǎo)下能表達(dá)Cre酶。

1.1.2 酶和試劑

rTaq酶、限制性內(nèi)切酶 Pst I、Xho I均購(gòu)于TaKaRa公司；Pfu酶、G418、Zeocin購(gòu)自上海生工；PEG3350及鮭魚(yú)精DNA購(gòu)于Sigma公司；其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由 TaKaRa公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (%)：蛋白胨 1，氯化鈉 0.5，酵母浸出物0.5。YPD培養(yǎng)基 (%)：酵母提取物1，蛋白胨2，葡萄糖2。YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基：即將YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖改為半乳糖。發(fā)酵培養(yǎng)基 (%)：蔗糖17，酵母粉 0.8，KH2PO40.2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.2。

1.1.4 引物

根據(jù)SGD (Saccharomyces genome database) 數(shù)據(jù)庫(kù)的 SNF4基因 (S000003083) 和 GenBank的pUG6序列 (Accession No. AF298793.1) 設(shè)計(jì)引物，所涉及的引物及其序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除組件的構(gòu)建

利用堿裂解法制備質(zhì)粒，以其為模板，以F1、R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得同源臂較短的SNF4基因敲除組件。以短同源臂的基因敲除組件為模板，以F2、R2為引物，PCR擴(kuò)增獲得同源臂較長(zhǎng)的SNF4基因敲除組件。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 SNF4顯性等位基因敲除菌株的構(gòu)建

根據(jù)LiAc/SS Carrier DNA/PEG高效酵母轉(zhuǎn)化法[11]，將SNF4敲除組件轉(zhuǎn)入感受態(tài)釀酒酵母YS2。利用G418篩選與同源組件發(fā)生重組的克隆子，并以使用A-B、C-D、A-D、A-KanB、KanC-D引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。采用pSH65質(zhì)粒與YPG誘導(dǎo)、G418抗性篩選 Kanr抗性標(biāo)記丟失克隆子，用 A-KanB、KanC-D、A-D引物進(jìn)行 PCR驗(yàn)證。將陽(yáng)性克隆連續(xù)傳8~10代，誘導(dǎo)pSH65質(zhì)粒丟失，最終獲得SNF4顯性等位基因的敲除菌株。

1.2.3 SNF4等位基因完全敲除菌株的構(gòu)建

重復(fù)SNF4顯性等位基因敲除步驟，敲除SNF4隱性等位基因，獲得 SNF4等位基因完全敲除菌株YS2-SNF4△。

1.2.4 SNF4等位基因完全敲除菌株遺傳穩(wěn)定性

將YS2-△SNF4連續(xù)傳18代，每36 h轉(zhuǎn)接1次，隨機(jī)挑取每一代酵母的單菌落使用A-D、A-B、C-D三對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，研究其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 SNF4等位基因完全敲除菌株生長(zhǎng)速率分析

以 1%的接種量分別接種 YS2和 YS2-△SNF4于50 mL YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每2小時(shí)取樣檢測(cè)其OD600值。

1.2.6 SNF4等位基因完全敲除菌株乙醇產(chǎn)量分析

將YS2、YS2-△SNF4接種到100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng) (0~8 h：好氧培養(yǎng)，8 h后發(fā)酵結(jié)束：靜置厭氧培養(yǎng))，每隔 12小時(shí)取樣，檢測(cè)殘?zhí)橇亢桶l(fā)酵液中乙醇含量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母 YS2中 SNF4基因的克隆和序列分析

利用玻璃珠法提取 YS2基因組[13]，以基因組DNA為模板，用引物A-D擴(kuò)增獲得SNF4基因全長(zhǎng)(GenBank Accession No. HQ386858 )。Blast分析表明，Saccharomyces cerevisiae YS2的SNF4基因與Saccharomyces cerevisiae S288c的SNF4基因 (SGD No. S000003083) 具有很高的同源性。

2.2 SNF4等位基因敲除組件的構(gòu)建

以F1、R1為引物，利用PCR獲得帶有2個(gè)LoxP位點(diǎn)和Kanr篩選標(biāo)記基因片段，結(jié)果表明大小與理論預(yù)計(jì) (1 690 bp) 一致。以F2、R2為引物，PCR擴(kuò)增到具有同源臂較長(zhǎng)的SNF4等位基因敲除組件，結(jié)果表明大小與理論預(yù)計(jì) (1 715 bp) 一致，SNF4等位基因敲除組件構(gòu)建成功。

2.3 SNF4顯性等位基因敲除菌株的驗(yàn)證

PCR驗(yàn)證結(jié)果 (圖1) 可知，在出發(fā)菌株YS2中，泳道1~3條帶大小與預(yù)期大小 (542 bp、1 603 bp、951 bp) 一致，表明YS2中存在SNF4基因。在轉(zhuǎn)化克隆子中，泳道6有2條帶，泳道7~8均有單一條帶并與理論值 (2 200、1 600、1 076、928 bp) 相符，表明釀酒酵母YS2基因組中SNF4顯性等位基因已經(jīng)與敲除組件發(fā)生了正確的同源重組，成功敲除了SNF4顯性等位基因。然而，泳道4~6均有與SNF4基因大小相一致的條帶，表明轉(zhuǎn)化克隆子中還存在SNF4隱性等位基因。

圖1 篩選陽(yáng)性克隆子Fig. 1 Screening for positive clones. M: 200 bp marker; 1,5: A-B; 2,6: A-D; 3,4: C-D; 7: A-KanB; 8: KanC-D.

2.4 Kanr篩選標(biāo)記的切除

pSH65質(zhì)粒轉(zhuǎn)到陽(yáng)性克隆子中，在YPG的誘導(dǎo)下會(huì)產(chǎn)生Cre重組酶，切除方向相同的2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，留下1個(gè)LoxP位點(diǎn)。通過(guò)平板影印技術(shù)和G418抗性篩選，可從YPD平板上獲得抗性標(biāo)記丟失的菌株 (圖2)，使用引物A-KanB、KanC-D、A-D進(jìn)行驗(yàn)證 (圖3)，其中用A-KanB、KanC-D引物沒(méi)有條帶出現(xiàn)，用A-D得到的目的條帶大小與預(yù)測(cè)的結(jié)果 ((746+1 603) bp) 一致，說(shuō)明了Kanr已被正確切除。

圖2 G418抗性丟失細(xì)胞的篩選Fig. 2 Selection of cells without G418 resistance. Left: YPD plate; right: YPD+G418 plate.

圖3 SNF4單倍體缺失菌株Kanr基因的驗(yàn)證Fig. 3 Verification of SNF4 haploids with Kanrlost. M: 200 bp marker; 1: A-KanB; 2: KanC-D; 3: A-D.

2.5 SNF4等位基因的完全敲除與驗(yàn)證

采用相同的轉(zhuǎn)化和篩選方法敲除SNF4隱性等位基因，切除Kanr篩選標(biāo)記，用引物A-B、C-D、A-D驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，電泳結(jié)果 (圖4) A-B、C-D沒(méi)有克隆出條帶，A-D得到的條帶與理論值 (746 bp) 一致。將A-D得到的PCR產(chǎn)物連接到PMD-18T載體上測(cè)序，與SGD上的序列比對(duì)，結(jié)果一致。表明釀酒酵母YS2的SNF4等位基因已經(jīng)完全被敲除。

圖4 SNF4二倍體缺失菌株的驗(yàn)證Fig. 4 Verification of diploid with SNF4 lost. M: 200 bp marker; 1: A-D product of PCR; 2: A-B product of PCR; 3: C-D product of PCR.

2.6 缺失菌株YS2-△SNF4的遺傳穩(wěn)定性

在連續(xù)傳代 18代的缺失菌株中，隨機(jī)挑取 98個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果 (表2) 表明：A-B、C-D均沒(méi)有克隆出任何條帶，A-D均可得到預(yù)期的條帶，表明所構(gòu)建的缺失菌株 YS2-△SNF4具有很高的遺傳穩(wěn)定性。

表2 缺失菌株YS2-△SNF4的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability test of YS2-△SNF4

2.7 細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

液體平行培養(yǎng)YS2和YS2-△SNF4菌株，繪制生長(zhǎng)曲線 (圖5)。從圖中可以看出，在生長(zhǎng)的前期 (0~34 h)，YS2-△SNF4比 YS2生長(zhǎng)速度慢，但在后期 (36 h之后)，兩株菌的生長(zhǎng)速率基本一致。

圖5 YS2-△SNF4和YS2生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Culture curve of YS2 and YS2-△SNF4.

2.8 乙醇發(fā)酵的試驗(yàn)

對(duì)YS2和YS2-△SNF4分別進(jìn)行靜置厭氧發(fā)酵，用 DNS法測(cè)殘?zhí)橇亢陀脷庀嗌V分析乙醇含量(圖6)。結(jié)果說(shuō)明，缺失菌株YS2-△SNF4和出發(fā)株YS2在96 h時(shí)乙醇產(chǎn)量均為最高，YS2-△SNF4可達(dá)8.38% (V/V)，比YS2 (7.79%) 提高了 7.57%。96 h 后葡萄糖消耗殆盡，YS2-△SNF4發(fā)酵液乙醇含量基本不變，而YS2菌株發(fā)酵液乙醇含量卻下降了 2.46%。以上結(jié)果表明，缺失菌株 YS2-△SNF4在葡萄糖阻遏效應(yīng)后的乙醇消耗能力降低了。

圖6 厭氧發(fā)酵殘?zhí)橇亢鸵掖嫉淖兓瘓DFig. 6 Changes in reducing sugar and ethanol production during anaerobic fermentation of the YS2 and YS2-△SNF4.

3 討論

基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型的分子生物學(xué)技術(shù)，它能應(yīng)用于特定突變的工程菌的構(gòu)建，與代謝工程相聯(lián)系，可改變細(xì)胞的代謝流向，阻斷代謝支路來(lái)提高產(chǎn)量，從而達(dá)到生物育種的目的[14-15]。如醛脫氫酶基因 (ALDH) 的敲除使克氏肺炎桿菌合成1,3-丙二醇的濃度提高了27%~42%[16]，敲除黑曲霉的 MNN9基因，使外源蛋白漆酶的分泌表達(dá)提高 14%[17]。另外，利用Cre-LoxP系統(tǒng)的基因敲除方法，可以重復(fù)利用抗性標(biāo)記基因，解決了工業(yè)釀酒酵母有效篩選標(biāo)記的缺乏問(wèn)題。

在釀酒酵母中，基因敲除對(duì)其細(xì)胞的生長(zhǎng)情況具有一定的影響[18]。YS2-△SNF4基因缺失突變株與出發(fā)菌株 YS2相比，在生長(zhǎng)初期，突變株的生長(zhǎng)速度較慢，這與Aon、Lin等的報(bào)道一致[19-20]。說(shuō)明SNF4基因?qū)τ诰S持釀酒酵母正常生長(zhǎng)起到一定的作用，敲除后細(xì)胞的生長(zhǎng)能力減弱。在耗糖方面，突變株在初期消耗速度較慢，可能是生長(zhǎng)速度較慢導(dǎo)致的，但是在 84~96 h時(shí)，葡萄糖消耗殆盡，YS2和YS2-△SNF4兩株菌株的乙醇的產(chǎn)量達(dá)到最高。此后，缺失菌株 YS2-△SNF4乙醇的含量基本上保持穩(wěn)定，而出發(fā)菌YS2的乙醇含量則逐漸下降，開(kāi)始利用以乙醇作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。這說(shuō)明當(dāng)葡萄糖消耗殆盡，SNF4基因缺失菌株在一定程度上影響了Snf1蛋白激酶復(fù)合體的活性[5,21]，減少了 ADH2基因的表達(dá)量，即不能利用乙醇作碳源，減弱乙醇至乙醛的分支代謝作用[21]，阻止乙醇再次被利用的可能性，進(jìn)而提高了乙醇的產(chǎn)量。

釀酒酵母的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常精細(xì)，基因間相互聯(lián)系，具有很強(qiáng)的調(diào)控能力。SNF4基因不僅對(duì)ADH2基因具有調(diào)控作用，另外對(duì)ALD6、SFA1、CAT8等基因存在一定的聯(lián)系[6,22]，因此，單一敲除 SNF4基因在一定程度上可以提高乙醇的產(chǎn)量，但要想進(jìn)一步提高乙醇的產(chǎn)率，可以通過(guò)原生質(zhì)體融合優(yōu)良的菌種或連續(xù)敲除幾個(gè)相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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Construction of Saccharomyces cerevisiae mutant with knockout of SNF4 gene

Xiaohua Lin1*, Chongrong Ke1*, Bisha Wu1, Yongbiao Zheng1, Li Li1, Youqiang Chen2,and Jianzhong Huang1
1 Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Engineering Research Center of Fujian Modern Fermentation Technology, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China
2 Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou
350108, China

Received: August 3, 2010; Accepted: December 16, 2010

Supported by: Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (No. nycytx-024-01-20), National Department Public Benefit Research Foundation (No. nyhyzx07-019), 948 Ministry of Agriculture Project (No. 2006-G37), Fujian Provincial Development and Reform Commission (No. [2004]477), Fujian Provincial Department of Science and Technology (No. 2005Q007).

Corresponding author: Jianzhong Huang. Tel/Fax: +86-591-22868212; E-mail: hjz@fjnu.edu.cn*These authors contributed equally to this study.

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金 (No. nycytx-024-01-20)，公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè)) 科研專項(xiàng)項(xiàng)目 (No. nyhyzx07-019)，農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目 (No.2006-G37)，福建省發(fā)改委重大項(xiàng)目 (No. [2004]477)，福建省科技廳平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目 (No. 2005Q007) 資助。