高玉龍，孫芬芬，侯磊，高宏雷，祁小樂，劉娣，華育平，王笑梅 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱 50086 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 5000 東北林業(yè)大學(xué)博士后流動站，哈爾濱 50040

雞法氏囊B淋巴細(xì)胞中與雞傳染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白篩選

高玉龍1,2,3，孫芬芬2，侯磊2，高宏雷2，祁小樂2，劉娣1，華育平3，王笑梅2
1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱 150086
2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001
3 東北林業(yè)大學(xué)博士后流動站，哈爾濱 150040

為了獲得雞法氏囊B淋巴細(xì)胞中與雞傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2相互作用的蛋白質(zhì)，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，用IBDV VP2蛋白為誘餌蛋白，篩選雞法氏囊B淋巴細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫。將表達(dá)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含IBDV VP2誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞，檢測報告基因在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基 (SD/-Leu/-Trp/-His) 上表達(dá)情況，進(jìn)一步經(jīng)β-半乳糖苷酶報告基因檢測，篩選到16個陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)測序分析獲得5個原雞基因序列，分別是：線粒體DNA、蛋白質(zhì)O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉(zhuǎn)移酶、腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白、微管解聚相關(guān)蛋白質(zhì)和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2。Co-IP試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)VP2蛋白能夠與腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉(zhuǎn)移酶和軟骨蛋白硫酸蛋白相互作用。為研究IBDV與宿主細(xì)胞相互作用以及細(xì)胞受體篩選奠定了基礎(chǔ)。

傳染性法氏囊病病毒，B淋巴細(xì)胞，cDNA表達(dá)文庫，蛋白相互作用，酵母雙雜交

Abstract:To screen the interactive proteins with IBDV Gt VP2 protein from cDNA library of B Lymphoid cells of the bursa of fabricius. The expression cDNA library plasmids was transformed to the yeast competent cells, which have the bait plasmid-Gt VP2. After testing for growth in synthetic complete medium lacking histidine and uracil and for production of β-galactosidase(X-gal), we obtained 16 positive clones. We searched the gene sequences of positive clones in the NCBI website. The blast results showed that five positive clones were the gallus sequences. They were Gallus gallus breed mitochondrial DNA, O_GlcNAc transferase, Tumor protein p53 binding protein, Stathmin and Chondroitin sulfate GalNAcT-2, respectively. This study is helpful for the further identifying the receptors of IBDV in B Lymphoid cells of the bursa of fabricius.

Keywords:infectious bursa disease virus (IBDV), B Lymphoid cells, cDNA expression library, protein-protein interactions, yeast two-hybrid system

雞傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease，IBD) 是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV) 引起的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病。IBDV屬于雙 RNA病毒科(Birnaviridae) 禽雙RNA病毒屬 (Avibirnavirus)。法氏囊是IBDV感染宿主及其復(fù)制的組織基礎(chǔ)，IBDV的易感細(xì)胞為法氏囊B淋巴細(xì)胞，IBDV感染雞后，首先在法氏囊B淋巴細(xì)胞中復(fù)制、增殖，進(jìn)而引起發(fā)病，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制[1]，以致誘發(fā)多種疾病或引起多種疫苗免疫失敗[2-4]。

VP2蛋白是IBDV的主要宿主保護(hù)性抗原，具有一個構(gòu)象依賴性的中和抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是病毒的主要衣殼蛋白，構(gòu)成病毒的外表面，決定病毒毒力和細(xì)胞嗜性[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，VP2蛋白的206~350位氨基酸是影響病毒與細(xì)胞受體相互作用的位點(diǎn)[7]，所以推測其與宿主細(xì)胞作用及病毒感染有密切關(guān)系[8]。對IBDV的晶體結(jié)構(gòu)研究表明，幾個嗜性決定簇定位于VP2蛋白頂端，暴露于最外側(cè)，推測這些氨基酸殘基直接與細(xì)胞受體相互作用[9]。為了研究IBDV與宿主細(xì)胞的相互作用，篩選法氏囊B淋巴細(xì)胞上與VP2蛋白相互作用的蛋白，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以IBDV Gt VP2蛋白為誘餌蛋白，從雞法氏囊B淋巴細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫中篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)分子，為鑒定IBDV細(xì)胞受體、研究IBDV與宿主細(xì)胞相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

酵母雙雜交表達(dá)載體 pDESTTM32、Mav203酵母菌株、鮭魚精 DNA、酵母質(zhì)粒小提試劑盒、BP ClonaseTMEnzyme Mix、LR ClonaseTMEnzyme Mix均購自美國 Invitrogen公司；各種營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、X-gal、二甲基甲酰胺 (DMF)、3-Aminotriazole(氨基三唑) 購自 Clontech公司；大腸桿菌 E. coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T、2×HotStart Taq PCR MasterMix購自TaKaRa公司。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗、硝酸纖維素膜、Flag單克隆抗體均購自Sigma公司。

1.2 酵母感受態(tài)制備及文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

攜帶有 IBDV VP2誘餌質(zhì)粒 (pDESTTM32-GtVP2) 的酵母菌Mav203為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存[10]。接種該菌株于 250 mL 三角燒瓶中，加 20 mL SD/-Leu液體培養(yǎng)基，30 ℃過夜培養(yǎng)。次日稀釋至300 mL SD/-Leu液體培養(yǎng)基中 (OD600=0.1)，繼續(xù)搖至OD600=0.5。室溫下2 500 r/min離心8 min，棄上清；30 mL無菌水重懸沉淀，室溫下2 500 r/min離心 5 min，棄上清。沉淀懸于 1.5 mL 1×乙酸鋰(LiAc)/0.5×TE，室溫孵育10 min。將上述感受態(tài)細(xì)胞懸液分裝到30個1.5 mL EP管中，每管50 μL。加1 μg表達(dá)文庫質(zhì)粒[11]和5 μL高質(zhì)量滅活的鮭魚精 DNA 于每個 EP管中，加 300 μL 1×LiAc/40%PEG-3350/1×TE到每管，30 ℃水浴30 min。每管中加 40 μL 二甲基亞砜 (DMSO)，42 ℃作用 10 min。將30管轉(zhuǎn)化菌液分別涂布于30個15 cm SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT平板，30 ℃培養(yǎng)4 d，待酵母菌長到3 mm左右備用。

1.3 β-半乳糖苷酶 (X-gal) 活性的檢測

觀測轉(zhuǎn)化平板上陽性克隆的生長，其間逐步將生長出的陽性克隆全部劃線到 SD/-Trp/-Leu篩選平板上，同時每個平板分別設(shè)強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性對照酵母菌，制作Master平板，30 ℃培養(yǎng)24 h。然后將其轉(zhuǎn)印到滅菌NC膜上，將膜放入YPAD平板上，30 ℃培養(yǎng) 18~24 h。稱取 10 mg X-gal溶于 100 μL DMF，加 60 μL β-巰基乙醇和 10 mL Z buffer，取 2層直徑為125 mm的濾紙浸入上述溶液，將多余的液體吸出。將長出菌落的NC膜置于液氮中10~30 s后取出恢復(fù)至室溫，將其平鋪在浸泡有 X-Gal緩沖溶液的濾紙上，放于37 ℃溫箱孵育過夜。將呈現(xiàn)藍(lán)色的克隆在 SD/-Trp/-Leu選擇平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)1次后，再次進(jìn)行X-gal試驗(yàn)以進(jìn)一步排除假陽性。

1.4 陽性克隆鑒定及基因信息分析

對X-gal試驗(yàn)為陽性的酵母菌，從Master板上挑菌搖于5 mL的SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，用酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取酵母質(zhì)粒。取5 μL質(zhì)粒，用相應(yīng)載體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接到 pMD18-T載體上，挑取陽性克隆進(jìn)行序列測定。利用Blast分析基因信息。

1.5 相互作用蛋白Co-IP驗(yàn)證

分別將酵母雙雜交篩選到的候選基因克隆到pCAGGS的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，其C末端引入Flag標(biāo)簽，同時構(gòu)建IBDV VP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)酶切鑒定及測序正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒后分別與VP2真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，用700 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心7 min，吸取上清置一新的EP管中，加入10 μL Protein G后，加抗VP2單克隆抗體7 μL，4 ℃低速旋轉(zhuǎn)過夜，次日4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL裂解液重懸，離心后棄上清，加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，運(yùn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到NC膜，用抗Flag單克隆抗體作為一抗，二抗用HRP標(biāo)記的抗鼠IgG二抗，進(jìn)行Western blotting分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞法氏囊B淋巴細(xì)胞cDNA文庫篩選

將cDNA表達(dá)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Mav203酵母菌(含有誘餌質(zhì)粒pDESTTM32-VP2)，在SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT篩庫平板上有200多個陽性克隆，將生長出的陽性克隆全部接種到SC-Trp-Leu營養(yǎng)缺陷型平板制作Master板，生長3~4 d后，進(jìn)行X-gal顯色反應(yīng)，初步篩到16個陽性克隆，見圖1。

圖1 X-gal藍(lán)斑顯色試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of LacZ reporter gene.

2.2 陽性克隆的PCR鑒定

將X-gal篩選的16個陽性克隆用酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并用Prey質(zhì)粒重組位點(diǎn)兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以0.8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明從 1、2、3、4、10和12號質(zhì)粒共擴(kuò)增得到6個不同的基因片段 (圖2)，其他質(zhì)粒為假陽性。

2.3 陽性克隆測序及基因信息分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果進(jìn)行Blast同源性比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選到的文庫質(zhì)粒cDNA插入片段均為已知原雞序列，與原雞序列同源性均在99%以上。其中4號和12號質(zhì)粒為同一個基因，是原雞線粒體DNA。其他基因編碼不同蛋白，詳細(xì)結(jié)果見表 1。對這 5個蛋白進(jìn)行了跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果表明 5個蛋白均沒有跨膜區(qū)，其中軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2存在一個信號肽區(qū)。

圖2 酵母質(zhì)粒PCR電泳圖Fig. 2 PCR products of yeast positive plasmids. 1: No. 10 plasmid; 2: negative control; 3: No. 12 plasmid; 4: No. 1 plasmid; 5: No. 4 plasmid; 6: No. 2 plasmid; 7: No. 3 plasmid;8: pDEST22 control; M: 1 kb DNA marker.

表1 法氏囊B淋巴細(xì)胞中與IBDV VP2蛋白相互作用蛋白生物學(xué)信息Table 1 Biology information of proteins of B lymphocyte of bursa interacting with IBDV VP2

2.4 Co-IP試驗(yàn)結(jié)果

免疫共沉淀試驗(yàn)可用于檢測蛋白之間的相互作用，為了進(jìn)一步驗(yàn)證酵母雙雜交篩選到的候選蛋白與IBDV VP2蛋白相互作用，分別構(gòu)建了帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別與VP2共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后進(jìn)行Co-IP檢測，結(jié)果見圖3。腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白 (泳道1)、蛋白質(zhì)O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉(zhuǎn)移酶 (泳道2) 和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (泳道4)均出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的蛋白條帶，表明VP2蛋白可以分別與它們作用，將其沉淀下來，而VP2蛋白不能沉淀微管解聚相關(guān)蛋白 (泳道5)。

圖3 免疫共沉淀檢測結(jié)果Fig. 3 Results of Co-IP assay. 1: tumor protein p53 binding protein+VP2; 2: O_GlcNAc+VP2; 3: marker; 4: chondroitin sulfate GalNAcT-2+VP2; 5: stathmin+VP2; 6: vero cell only; 7:VP2 only.

3 討論

病毒能否吸附到相應(yīng)的細(xì)胞是該病毒能否完成感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。病毒與細(xì)胞特異性結(jié)合的本質(zhì)是病毒蛋白(配體)與細(xì)胞膜表面特定蛋白 (受體) 的特異性結(jié)合[12]。病毒粒子上與細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白質(zhì) (配體)，一般都是病毒表面蛋白。VP2蛋白是IBDV的主要衣殼蛋白，構(gòu)成了 IBDV的外表面。IBDV的配體主要集中在VP2蛋白，推測其與宿主細(xì)胞作用及病毒感染有密切關(guān)系[12]。所以本研究選取IBDV VP2蛋白為誘餌蛋白來篩選雞法氏囊B淋巴細(xì)胞 cDNA表達(dá)文庫。希望從中篩選到與 IBDV相互作用的蛋白，為研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用以及IBDV細(xì)胞受體篩選奠定基礎(chǔ)。

本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)從雞法氏囊B淋巴細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫中篩選到16個陽性克隆，經(jīng)反復(fù)篩選及序列測定得到5個不同的候選基因，均為原雞序列。它們分別為線粒體 DNA (Gallus gallus breed mitochondrial DNA)、蛋白質(zhì)O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉(zhuǎn)移酶 (O_GlcNAc transferase)、腫瘤蛋白 p53結(jié)合蛋白 (Tumor protein p53 binding protein)、微管解聚相關(guān)蛋白質(zhì) (Stathmin) 和軟骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (Chondroitin sulfate GalNAcT-2)。腫瘤蛋白 p53是一種核蛋白，其在調(diào)控細(xì)胞周期中起重要作用。該蛋白包含DNA結(jié)合寡聚化域和轉(zhuǎn)錄激活域，腫瘤蛋白 p53蛋白與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，形成四聚體結(jié)構(gòu)，激活下游基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長[13]。軟骨蛋白硫酸 GalNAcT-2廣泛分布于高爾基體中，其能與金屬離子結(jié)合，具有轉(zhuǎn)移酶功能[14]。微管解聚相關(guān)蛋白 (Stathmin)，是脊椎動物細(xì)胞中普遍存在的胞質(zhì)內(nèi)可溶性磷蛋白，能夠高效調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化[15-16]。蛋白質(zhì) O_GlcNAc糖基化轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[17]。

為了進(jìn)一步在體外驗(yàn)證這些蛋白與 IBDV VP2蛋白的相互作用，本試驗(yàn)又分別構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行了Co-IP試驗(yàn)，結(jié)果表明VP2蛋白能夠?qū)⒛[瘤蛋白p53結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化轉(zhuǎn)移酶和軟骨蛋白硫酸蛋白沉淀下來，進(jìn)一步證實(shí)了它們能夠相互作用。而與微管解聚相關(guān)蛋白的Co-IP試驗(yàn)，我們重復(fù)了3次，VP2蛋白均不能將其沉淀下來，推測這兩個蛋白不能夠相互作用，酵母雙雜交結(jié)果可能為假陽性。

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明這幾個蛋白均沒有跨膜區(qū)，不是膜蛋白，那么這些蛋白是怎樣與IBDV VP2蛋白相互作用、在IBDV感染B淋巴細(xì)胞中充當(dāng)什么角色還不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

REFERENCES

[1] Müller H. Replication of infectious bursal disease virus in lymphoid cells. Arch Virol, 1986, 87(3/4): 191?203.

[2] LuKert PD, Saif YM. Infectious bursal disease//Disease of Poultry. 10th. USA: lowa state University Press, 1997:914?937.

[3] Nagarajan MM, Kibenge FS. Infectious bursal disease virus:a review of molecular basis for variations in antigenicity and virulence. Can J Vet Res, 1997, 61(2): 81?88.

[4] Montgomery RA, Dallman MJ. Semi-quantitative polymerase chain reaction analysis of cytokine and cytokine receptor gene expression during thymic ontogeny. Cytokine,1997, 9(10): 717?726.

[5] Saugar I, Luque D, O?a A, et al. Structural polymorphism of the major capsid protein of a double-stranded RNA virus: an amphipathic α helix as a molecular switch.Structure, 2005, 13(7): 1007?1017.

[6] Luque D, Saugar I, Rodríguez JF, et al. Infectious bursal disease virus capsid assembly and maturation by structural rearrangements of a transient molecular switch. J Virol,2007, 81(13): 6869?6878.

[7] van Loon AA, de Haas N, Zeyda I, et al. Alteration of amino acids in VP2 of very virulent infectious bursal disease virus results in tissue culture adaptation and attenuation in chickens. Gen Virol, 2002, 83(1): 121?129.

[8] Brandt M, Yao K, Liu MH, et al. Molecular determinants of virulence, cell tropism, and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus. J Virol, 2001, 75(24):11974?11982.

[9] Coulibaly F, Chevalier C, Gutsche I, et al. The birnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses. Cell, 2005, 120(6):761?772.

[10] Li TQ, Gao YL, Gao HL, et al. Construction of “bait vector” for GxVP2 and GtVP2 of IBDV and detection of its self-activation in yeast two-hybrid system. Chin J Prevent Vet Med, 2008, 30(1): 1?4.李鐵強(qiáng), 高玉龍, 高宏雷, 等. IBDV強(qiáng)、弱毒VP2誘餌載體構(gòu)建及在酵母雙雜交系統(tǒng)中自激活作用的檢測.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2008, 30(1): 1?4.

[11] Gao YL, Liu W, Gao HL, et al. Construction of three-frame cDNA expression library of B Lymphoid cells in the bursa of Fabricius. Chin J Prevent Vet Med, 2008,30(1): 10?13.高玉龍, 劉偉, 高宏雷, 等. 雞法氏囊 B淋巴細(xì)胞三框cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2008,30(1): 10?13.

[12] Haywood AM. Virus receptors: binding, adhesion strengthening, and changes in viral structure. Virology,1994, 68(1): 1?5.

[13] Giono LE, Manfredi JJ. The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle checkpoints. J Cell Physiol, 2006, 209(1): 13?20.

[14] Uyama T, Kitagawa H, Tanaka J, et al. Molecular cloning and expression of a second chondroitin N-acetylgalactosaminyl transferase involved in the initiation and elongation of chondroitin/dermatan sulfate. J Biol Chem, 2003, 278(5): 3072?3078.

[15] Rubin CL, Atweh GF. The tole of Stathmin in the regulation of the cell cycle. J Cell Biol, 2004, 93(2): 242?250.

[16] Hasegawa A, Hisatomi O, Yamamoto S, et al. Stathmin expression during newt retina regeneration. Exl Eye Res,2007, 85(4): 518?527.

[17] Chikanishi T, Fujiki R, Hashiba W, et al. Glucose-induced expression of MIP-1 genes requires O-GlcNAc transferase in monocytes. Biochem Bioph Res Co, 2010, 394(4):865?870.

Screening proteins interacting with infectious bursa disease virus Gt VP2 from cDNA library of B lymphoid cells of the bursa of fabricius

Yulong Gao1,2,3, Fenfen Sun2, Lei Hou2, Honglei Gao2, Xiaole Qi2, Di Liu1, Yuping Hua3,and Xiaomei Wang2
1 Postdoctoral Research Center, Heilongjiang Academy of Agriculture Science, Harbin 150086, China
2 State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China
3 Postdoctoral Research Station, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China