王振亞，王彥彬，陳紅英，邵攀峰，寧曉東，潘娜，韓利靜，崔保安

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

2 河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002

豬IL-18在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

王振亞1,2，王彥彬1,2，陳紅英1,2，邵攀峰1,2，寧曉東1，潘娜1，韓利靜1，崔保安1,2

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

2 河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002

IL-18作為一種多效性細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答及各種生理功能中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，根據(jù)豬IL-18基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，將編碼豬IL-18的成熟蛋白基因亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual中，并在C端融合6個(gè)組氨酸標(biāo)簽以利于純化，然后轉(zhuǎn)化到含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，SDS-PAGE可檢測到分子量為18 kDa左右的重組蛋白，Western blotting證實(shí)該重組蛋白可與兔抗豬IL-18抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。純化后蛋白能明顯促進(jìn)豬T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表明所表達(dá)的IL-18具有較高的生物活性。此研究為進(jìn)一步開發(fā)研制新型免疫佐劑奠定了基礎(chǔ)。

豬白細(xì)胞介素-18，昆蟲細(xì)胞，表達(dá)

Abstract:IL-18, as a polyphonic cytokine, is important in immune response and physiologic function. We designed one pair of primers, amplified the porcine IL-18 gene fused with a C-terminal 6×Histidine tag, and then subcloned into the pFastBacDual of Baculovirus transfer vector and transformed into DH10Bac containing a shuttle vector of Bacmid. After co-transfecting the recombinant plasmid into insect cells, the 18 kDa expressed protein of porcine IL-18 was detected by SDS-PAGE; the specificity of expressed protein was confirmed by Western blotting. The purified porcine IL-18 protein induced obvious proliferation of porcine T lymphocytes in vitro, which indicated that the expression of IL-18 had high biological activity.

Keywords:porcine Interleukin-18, insect cells, expression

白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18) 是一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子，能誘導(dǎo)Th1等細(xì)胞產(chǎn)生大量 IFN-γ，故又稱為干擾素 γ誘生因子。研究表明IL-18可刺激Th1細(xì)胞高水平誘生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，顯著增強(qiáng)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等免疫調(diào)節(jié)功能。1995年日本學(xué)者 Okamura等[1]首次報(bào)道從中毒性休克的鼠肝臟中克隆出了該因子。1996年 Ushio等[2]從鼠cDNA庫中篩選到人IGIF基因，其序列與所有已知的細(xì)胞因子不同，并能在大腸桿菌中表達(dá)，且生物活性多樣，如抗病毒、抗結(jié)核分支桿菌、抗真菌[3]、抗腫瘤免疫[4]、抗變態(tài)反應(yīng)性疾病作用[5]及前炎因子活性[6]，故將其正式命名為白細(xì)胞介素-18。1999年Muneta等[7-8]從豬肺泡巨嗜細(xì)胞中克隆到豬IL-18，并證明表達(dá)的豬 IL-18成熟蛋白比前體蛋白具有更高的活性。

IL-18作為一種多效性細(xì)胞因子[6]，在機(jī)體免疫應(yīng)答和各種生理功能的調(diào)節(jié)作用及其臨床應(yīng)用受到重視，迄今已成功克隆了人和多種動(dòng)物的 IL-18基因，IL-18 mRNA在多種器官、組織、細(xì)胞中均可測到，如胸腺、肝臟、脾臟等。在抗腫瘤、抗感染及免疫調(diào)節(jié)、抗超敏反應(yīng)、抗自身免疫性糖尿病、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面有著積極的作用[3-5]，具有潛在的應(yīng)用前景。IL-18也具有抗多種病毒功能，尤其是對(duì)甲型流感病毒、單純皰疹病毒(HSV-1)、牛痘病毒及腦心肌炎病毒(EMCV)的復(fù)制和表達(dá)具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期在 IL-18方面做了大量的工作。豬IL-18[9]、雞IL-18[10]、鴨IL-18[11]在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都已經(jīng)作了大量的基礎(chǔ)研究。為了研究豬IL-18在昆蟲細(xì)胞中真核表達(dá)的特征，探索其作為免疫佐劑在生物工程制品中的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)從已經(jīng)構(gòu)建的pGEM-pIL-18重組載體中克隆出豬IL-18成熟蛋白基因，并在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

pGEM-pIL-18重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacDual和E. coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司。

1.1.2 細(xì)胞

SF-9昆蟲細(xì)胞由中國科學(xué)院武漢病毒研究所王漢中研究員惠贈(zèng)。

1.1.3 酶類和主要試劑

Ex Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、PstⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；鼠抗豬6×His單克隆抗體和 LipofecttamineTM2000 Reagent購自Invitrogen公司；兔抗豬IL-18單克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP均為 Bioszune公司產(chǎn)品；GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；Grace's培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

應(yīng)用Primer (Version 5.0) 基因分析軟件，參照pGEM-pIL-18基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引物5′端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子，下游引物5′端引入PstⅠ酶切位點(diǎn)、終止密碼子和6×His標(biāo)簽序列。上游引物 P1：5′-CGCGAATTC ATGTACTTTGG CAAGCTT-3′；下游引物 P2：5′-CGCCTGCAGTTA3′ (下劃線為酶切位點(diǎn)，粗體為密碼子，加框?yàn)?×His標(biāo)簽序列)。該引物擴(kuò)增長度為491 bp，含豬IL-18成熟蛋白基因。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后，克隆到同樣處理的pFastBacDual載體中，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，最后將陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.2.3 轉(zhuǎn)染及高滴度重組桿狀病毒的獲得

轉(zhuǎn)化到含穿梭載體 Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將重組質(zhì)粒 rBacmid-IL-18轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的SF-9昆蟲細(xì)胞。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收集細(xì)胞液，離心取上清作為第1代重組病毒，按1∶10稀釋后，感染處于對(duì)數(shù)生長期SF-9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)2~3 d，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)收集上清即得第 2代病毒，用同樣的方法再傳一代，篩選到高滴度的含有豬IL-18基因的重組桿狀病毒。提取DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)

收集不同時(shí)間1 mL有明顯病變的細(xì)胞液，5 000 r/min 離心5 min，沉淀加入80 μL的去離子水懸浮，加入20 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.5 表達(dá)蛋白的純化和Western blotting檢測

收集表達(dá)豬IL-18的病變細(xì)胞，PBS (50 mmol/L，pH 7.4) 液懸浮后，超聲波裂解細(xì)胞，5 000 r/min離心 5 min。經(jīng)鎳親和層析柱純化，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將轉(zhuǎn)印好的 NC膜用5%脫脂乳封閉，然后與兔抗豬IL-18單克隆抗體作用，經(jīng)TBST 洗滌后與工作濃度的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作用，最后以DAB顯色，觀察特異性條帶。

1.2.6 表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性測定

分離豬淋巴細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋后，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105~5×105個(gè)/mL，加入純化后的蛋白，使終濃度為200 μg/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第1行每孔50 μL淋巴細(xì)胞液，第2、3行設(shè)為陰性和空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)48 h，然后每孔加入 20 μL MTT (5.0 mg/mL)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，加入100 μL DMSO，混勻，振蕩3 min，以空白對(duì)照孔調(diào)零為止，用酶標(biāo)儀測定OD570的值。

2 結(jié)果

2.1 良雜豬IL-18基因的PCR擴(kuò)增

利用 RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增 pGEM-pIL-18，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步檢測表明，獲得了 492 bp的DNA條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果一致 (圖1)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoresis map for RT-PCR product. M: DL2000 marker; 1, 2: RT-PCR product; 3: negative control.

2.2 重組載體的構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后插入到同樣處理的pFastBacDual載體中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒，命名為pFB-IL-18。轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，電泳出現(xiàn)有 1條450 bp左右的目的條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切，切出1條大小約為5 700 bp的條帶；經(jīng)EcoRⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，電泳出現(xiàn)2條帶：一條帶為載體，約為5 200 bp，另一條為插入的目的條帶，約為490 bp，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖 2)。序列測序顯示，該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實(shí)含有目的基因片段，且讀碼框正確，表明重組質(zhì)粒pFB-IL-18構(gòu)建成功。

圖2 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant transfer plasmid by digestion and PCR. M: λ-EcoT 14 I digest; 1: recombinant transfer plasmid digestion by EcoRⅠ+PstⅠ; 2: recombinant transfer plasmid digestion by EcoRⅠ; 3: recombinant transfer plasmid PCR product; m: DL2000 marker.

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PCR檢測

將 rBacmid-IL-18轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞后，分別收集重組桿狀病毒和野生桿狀病毒感染的病變細(xì)胞，提取DNA，用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳可見重組桿狀病毒在約3 000 bp處出現(xiàn)了特異性條帶，而野生桿狀病毒只在300 bp處出現(xiàn)了特異性條帶 (圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 轉(zhuǎn)染rBacmid-IL-18后PCR產(chǎn)物鑒定圖Fig. 3 Identification of PCR product after transfected with Bacmid-IL-18. M: λ-EcoT 14 I digest; 1: PCR products of rBacmid-IL-18 with primer M13; 2: PCR products of Bacmid with primer M13; m: DL2000 marker.

2.4 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)

將獲得的第 3代重組病毒接種到處于對(duì)數(shù)生長期的SF-9細(xì)胞，感染2 d后，于不同時(shí)間收獲細(xì)胞，與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后，煮沸5 min，進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果顯示，rBacmid-IL-18重組桿狀病毒在約18 kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，可見豬IL-18基因在昆蟲細(xì)胞中成功得到了表達(dá) (圖4)。

2.5 表達(dá)蛋白的純化和Western blotting檢測

收集表達(dá)豬IL-18的病變細(xì)胞，超聲波裂解后，鎳柱過濾，然后用不同咪唑濃度的洗脫緩沖液進(jìn)行階段洗脫，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)洗脫出了目的條帶(圖 5)，表達(dá)的蛋白成功進(jìn)行了純化。使用兔抗豬IL-18單克隆抗體作為一抗，對(duì)上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果表明，重組表達(dá)產(chǎn)物可被單克隆抗體所識(shí)別，證明本試驗(yàn)所得的表達(dá)蛋白具有特異性，為所需的目的蛋白 (圖5)。2.6 表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性測定

圖4 IL-18蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4 Analysis of IL-18 protein by SDS-PAGE. M: protein marker; 1-7: IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cells.

圖5 純化IL-18蛋白的Western blotting鑒定圖Fig. 5 Identification of purified IL-18 protein by Western blotting. M: protein marker; A1: SDS-PAGE of purified IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cells; B1: Western blotting of IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cell.

提取豬脾淋巴細(xì)胞后，用終濃度為 200 μg/mL的純化蛋白作用48 h，MTT和DMSO作用后，測定OD570的值。結(jié)果顯示，加有蛋白的試驗(yàn)組平均數(shù)值0.609±0.017，對(duì)照組平均數(shù)值為0.303±0.024，試驗(yàn)組數(shù)值明顯高于對(duì)照組，差異極顯著 (P＜0.01)。表明豬 IL-18表達(dá)蛋白能明顯提高豬淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，具有較高的生物學(xué)活性 (表1)。

3 討論

IL-18是一種強(qiáng)有力IFN-γ誘導(dǎo)劑，其生物學(xué)活性主要通過調(diào)節(jié) IFN-γ的表達(dá)來提高機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。通常情況下，機(jī)體內(nèi) IL-18表達(dá)量甚微，不可能直接提取純化，只有通過基因工程技術(shù)才能大量生產(chǎn)重組IL-18。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的真核基因表達(dá)系統(tǒng)[12]，桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，昆蟲細(xì)胞的蛋白質(zhì)后加工系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接近，能識(shí)別和切除信號(hào)肽[13]，能對(duì)表達(dá)的真核基因產(chǎn)物更好地進(jìn)行糖基化、磷酸化、脂肪酶化、酰胺化、切割信號(hào)肽以及形成三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)等[14]。在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白接近天然蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性、結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)、抗原性和免疫原性等與天然外源基因產(chǎn)物極其相似[15]。所以，用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬IL-18非常值得去探索。

表1 豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果 (OD570)Table 1 The result of chicken’s lymphocyte transforms test (OD570)

影響蛋白表達(dá)量的因素有許多，宿主細(xì)胞的生長狀態(tài)是影響病毒轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)的首要因素，生長狀態(tài)良好，密度合適的細(xì)胞最容易轉(zhuǎn)染成功，并獲得良好的表達(dá)量。培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基里面一般不加抗生素，所以，細(xì)胞很容易被細(xì)菌、支原體等污染，為了獲得狀態(tài)良好的細(xì)胞，首先，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要嚴(yán)格無菌操作，防止出現(xiàn)污染；其次，由于昆蟲細(xì)胞比較脆弱，所以在傳代時(shí)要小心輕柔地吹打，最好在吹打前輕輕拍打瓶底，使其自然脫落；最后，轉(zhuǎn)染時(shí)要掌握好細(xì)胞的密度和生長狀態(tài)。通過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染前24 h細(xì)胞鋪板，當(dāng)密度達(dá)到 70%~80%，細(xì)胞處在拉絲狀態(tài)時(shí)轉(zhuǎn)染最容易成功。另外，為了獲得較高的表達(dá)量，病毒不易傳代過多，一般傳3~5代最好。同時(shí)，選擇優(yōu)良的培養(yǎng)基和胎牛血清對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)也至關(guān)重要。

IL-18的基因克隆與表達(dá)已成功，分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)初步明確，在動(dòng)物試驗(yàn)階段表現(xiàn)出明顯的免疫增強(qiáng)作用。雖然 IL-18要應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)還有待于進(jìn)一步的深入研究，但是 IL-18作為疫苗佐劑應(yīng)用于動(dòng)物新型疫苗的開發(fā)，在提高豬體抗感染力、增強(qiáng)滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究將編碼豬 IL-18成熟蛋白基因重組于桿狀病毒表達(dá)載體中，成功地構(gòu)建了能夠表達(dá)豬IL-18成熟蛋白的重組桿狀病毒。Western blotting表明該病毒表達(dá)的豬IL-18成熟蛋白可被兔抗豬IL-18單克隆抗體所識(shí)別，這表明用該系統(tǒng)表達(dá)的豬IL-18成熟蛋白具有免疫原性和生物學(xué)活性。純化后蛋白能明顯促進(jìn)豬T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表明所表達(dá)的IL-18具有較高的生物活性。此研究為進(jìn)一步研究豬IL-18功能性蛋白作為分子佐劑在疫苗免疫中的促進(jìn)作用及開發(fā)研制新型免疫增強(qiáng)劑定了基礎(chǔ)。

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Expression of porcine Interleukin-18 in baculovirus/insect cells

Zhenya Wang1,2, Yanbin Wang1,2, Hongying Chen1,2, Panfeng Shao1,2, Xiaodong Ning1, Na Pan1,Lijing Han1, and Baoan Cui1,2
1 College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 Henan Key Laboratory of Animal-Derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China