單麗偉，唐如春，劉三陽，范三紅,2，郭藹光,2

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100

2 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

小麥種子過氧化物酶WP1基因的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

單麗偉1，唐如春1，劉三陽1，范三紅1,2，郭藹光1,2

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100

2 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

WP1是小麥種子中最主要的陽離子過氧化物酶，該酶不僅參與種子的發(fā)育過程，而且影響面粉的加工品質(zhì)。首先構(gòu)建了WP1基因原核表達(dá)載體pET28a-WP1，并將其轉(zhuǎn)化到T7 Expression大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。His-tag融合的WP1主要以包涵體形式存在，使用Ni-NTA親和層析柱在變性條件下進(jìn)行純化，獲得純度大于98%的重組蛋白。重組WP1經(jīng)尿素梯度透析復(fù)性溶解后免疫新西蘭大白兔，最終獲得WP1多克隆抗體。ELISA分析結(jié)果顯示制備的WP1兔抗血清的效價(jià)大于1∶625 000；Western blotting結(jié)果證明制備的多克隆抗體對(duì)WP1具有很好的專一性。

小麥，種子過氧化物酶，WP1，表達(dá)純化，抗體制備

Abstract:Wheat peroxidases 1 (WP1) is the major cationic peroxidase of wheat (Triticum aestivum) grain, which is involved in the development of seeds and an important factor to affect the final processing quality of flour. We constructed a prokaryotic expression vector pET28a-WP1, and transformed it into E. coli host strain T7 Expression. His-tag fused WP1 existed as inclusion body, and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography under denatured condition. The purity of target protein reached 98%. The recombinant WP1 was refolded by gradient urea dialysis, then used as antigen to immune rabbit to prepare polyclonal antibody. The result of ELISA showed that the titer of rabbit anti-WP1 antiserum was higher than 1:625 000. The result of Western blotting demonstrated that the prepared WP1 polyclonal antibody could be used to detect WP1 with high specificity.

Keywords:Triticum aestivum, grain peroxidase, WP1, expression and purification, antibody preparation

過氧化物酶同工酶廣泛存在于各種植物中，它們參與了植物體內(nèi)許多重要的生理過程，如木質(zhì)化和栓化、激素代謝、細(xì)胞壁蛋白質(zhì)交聯(lián)、病原防御、耐鹽及抗氧化等[1]。植物過氧化物酶不僅在植物的生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，而且作為重要的商品酶應(yīng)用于生物催化、臨床檢測(cè)和生物技術(shù)研究等領(lǐng)域。如高分子材料的生產(chǎn)、有毒芳香化合物廢水的處理、基于ELISA的疾病診斷等[2-3]。

面粉是眾多食品加工的主要原料，如何改善面粉的加工性能是當(dāng)前小麥育種和食品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。育種研究者希望通過改變面粉中各種組分的含量改變面粉的加工性能，而食品加工研究者則希望通過在面粉中添加外源添加劑改變面粉的性質(zhì)。已有研究結(jié)果顯示，面粉中谷蛋白和醇溶蛋白的組成和含量、過氧化物酶活性、脂過氧化物酶活性、二硫鍵異構(gòu)酶活性、谷胱甘肽含量等均會(huì)不同程度影響面團(tuán)的特性，添加化學(xué)氧化劑、添加外源過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶等均能改變面團(tuán)的功能特征[4-6]。

1995年Converso等從小麥種子中純化到3種陽離子過氧化物酶組分，其中2種組分的理化性質(zhì)和催化特性接近，而第3種與前兩者差異較大[7]；2001年 Caruso等從面粉中純化到一種陽離子過氧化物酶，將其命名為WP1，并證明其具有抗真菌活性[8]；2002年Yamashita等從面粉中純化到一種36 kDa陽離子過氧化物酶[9]，分析了其 N-末端序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在糖基化現(xiàn)象，糖基主要為甘露糖和巖藻糖。本研究組從面粉中純化到一種陽離子過氧化物酶(WP1)[10]，并克隆了該酶對(duì)應(yīng)的基因，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其與大麥種子過氧化物酶BP1高度同源，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)合前人和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，小麥種子中存在非常強(qiáng)的過氧化物酶活力，WP1是小麥種子中最主要的陽離子過氧化物酶；應(yīng)該參與種子的成熟過程，存在于面粉中的WP1應(yīng)該對(duì)面團(tuán)形成具有顯著影響，但是WP1參與種子的成熟和面團(tuán)形成的機(jī)制目前尚不清楚。

本研究將小麥 WP1基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化獲得重組WP1。使用重組蛋白免疫兔子，制備獲得小麥WP1多克隆抗體，并對(duì)多克隆抗體的效價(jià)和專一性進(jìn)行了分析。為WP1的組織和細(xì)胞定位、在種子形成過程中的功能及其對(duì)面粉加工性能的影響等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、2-log DNA ladder、蛋白 marker等為 NEB公司產(chǎn)品；Ni-NTA Superflow agarose純化介質(zhì)為 Qiagen公司產(chǎn)品；PVDF (聚偏二氟乙烯膜) 轉(zhuǎn)印膜為 GE公司產(chǎn)品；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Pierce公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP-DAB顯色試劑盒購自北京Tiangen公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌 DH5α和表達(dá)菌株 T7 Expression為NEB公司產(chǎn)品；pET28a表達(dá)載體為 Novagen公司產(chǎn)品；含有WP1基因cDNA的pPCR-WP1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2只新西蘭大耳白兔，體重約2 kg。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

以含有WP1基因cDNA的質(zhì)粒pPCR-WP1為模板，P1、P2為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得目的片段，回收的 PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連入pET28a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。所用引物序列如下：P1：5′-AT GGAATTC GCGGAGCCTCCGGTGGCGCGC-3′，P2:5′-ATGAAGCTT CTAGCCAAGCCTTTCTGCAGC-3′。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)

將表達(dá)載體 pET28a-WP1導(dǎo)入大腸桿菌 T7 Expression表達(dá)菌株，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上篩選，挑取單菌落，在含有50 μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG (終濃度為0.5 mmol/L) 誘導(dǎo)。4 ℃、10 000×g 離心5 min收集菌體，5 mL菌液沉淀用 1 mL裂解緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑) 重懸，經(jīng)超聲破碎，分別取裂解菌液及離心后上清液，利用15% SDS-PAGE進(jìn)行分離檢測(cè)。

1.2.3 融合蛋白的親和純化

收集100 mL誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，加入10 mL裂解緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集沉淀。用裂解緩沖液洗滌沉淀 3次去除可溶性蛋白，然后再用含0.1% Triton X-100的裂解緩沖液洗滌3次去除膜蛋白。用含有8 mol/L 尿素的裂解緩沖液溶解獲得的包涵體，4 ℃、10 000 × g離心20 min，將上清載入Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱，用5倍柱體積的漂洗緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 6.3) 洗柱以除去雜蛋白，最后用3倍柱體積的洗脫緩沖液 (100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 5.9) 洗脫目的蛋白。收集洗脫組分，利用 15%SDS-PAGE進(jìn)行分離檢測(cè)。使用 Bio-Rad 公司的Quantity one軟件分析目的蛋白的相對(duì)量。

1.2.4 兔抗WP1血清的制備

依次用含 4、2、l、0.5、0.2 mol/L 尿素的 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液透析復(fù)性，然后與等體積弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合乳化后皮下多點(diǎn)注射，分4次進(jìn)行免疫。首次按800 μg/只劑量免疫，皮下6點(diǎn)注射；第 21、35、49天分別按 400 μg/只劑量免疫，皮下4點(diǎn)注射。每次免疫10 d后，每只兔子耳緣靜脈取血0.5~1 mL，分離抗血清，間接ELISA檢測(cè)免疫后血清效價(jià)。第60天時(shí)采全血，分離抗血清，?20 ℃保存，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)

取開花后15 d的小麥籽粒2 g，液氮中研磨后加入5 mL蛋白質(zhì)提取液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，1% 2-巰基乙醇，1 mmol/L PMSF)，充分研磨勻漿，10 000×g離心15 min后取上清，加蛋白上樣緩沖液，利用 15% SDS-PAGE進(jìn)行分離，再通過電轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印至Hybond-P PVDF膜上。以方法1.2.4中制備的兔抗血清為一抗 (1∶50)，用辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP) 的羊抗兔抗體為二抗 (1∶2 000)，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-WP1表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pPCR-WP1為模板，通過PCR擴(kuò)增WP1基因編碼區(qū) (不包含信號(hào)肽區(qū)，共996 bp)，將其重組入表達(dá)載體 pET28a。圖 1為重組質(zhì)粒 PCR和EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定結(jié)果，第1和2泳道均出現(xiàn)約1 000 bp的預(yù)期片段。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-WP1。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-WP1的雙酶切和PCR鑒定Fig. 1 Identification of recombinant vector pET28a-WP1 by double digestion and PCR. M: DNA marker; 1: pET28a-WP1 digested with EcoRⅠ and Hind ; 2: Ⅲidentification of pET28a-WP1 by PCR.

2.2 WP1融合蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建的表達(dá)載體 pET28a-WP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌T7 Expression 菌株，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，分別收集誘導(dǎo)2、4、6 h后樣品，使用15% SDS-PAGE分析表達(dá)量隨時(shí)間變化，結(jié)果如圖2A所示。與對(duì)照泳道相比，泳道2、3、4都出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的37 kDa條帶，且其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間而增加；誘導(dǎo) 4 h后，WP1即達(dá)到最大表達(dá)量?？扇苄苑治鼋Y(jié)果顯示，重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。將包涵體溶解于8 mol/L尿素溶液中，通過Ni-NTA瓊脂糖親和柱分離，最終獲得用于抗體制備的重組WP1。泳道灰度掃描分析結(jié)果顯示，重組蛋白純度大于98%，如圖2B所示。

圖 2 WP1在大腸桿菌中不同時(shí)間的表達(dá)情況及其分離純化的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of WP1 in different time and purification through Ni-NTA agarose affinity chromatography. (A) M: prestained protein marker; 1:un-induced control; 2?4: the expression of WP1 after 2, 4, 6 h induction respectively. (B) M: prestained protein marker; 1: total protein; 2: soluble protein after inducing; 3: the purified WP1.

2.3 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)

使用2 μg/mL的WP1抗原包被酶標(biāo)板，5%脫脂奶粉封閉，將抗血清或免疫前血清按稀釋度1∶1 000、1∶5 000、1∶25 000、1∶125 000、1∶625 000稀釋后加入酶標(biāo)板中孵育，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，最后以四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 為底物進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長的光吸收值。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果如圖3所示，每一點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)差用垂直短線表示。以O(shè)D陽/OD陰＞2.1為標(biāo)準(zhǔn)，制備的WP1兔抗血清效價(jià)在1∶625 000以上。

圖3 ELISA測(cè)定WP1兔抗血清效價(jià)Fig. 3 Titer of rabbit anti-WP1 antiserum was detected by ELISA.

2.4 Western blotting檢測(cè)

為了檢測(cè)制備的WP1抗血清的特異性，提取小麥籽粒中的可溶性蛋白，利用 15% SDS-PAGE分離，蛋白印跡后依次用WP1抗血清 (一抗) 和HRP山羊抗兔抗體 (二抗) 雜交，以二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)為底物進(jìn)行顯色，結(jié)果如圖4所示。圖4A為蛋白電泳結(jié)果，圖4B為Western blotting結(jié)果。圖4A中，第1泳道為重組的WP1，第2、3泳道分別為從“陜225”和“鄭農(nóng) 16”小麥種子中提取到的可溶性蛋白；圖4B中，每個(gè)泳道中均出現(xiàn)一條約37 kDa的特異條帶，說明WP1抗血清不僅能與重組WP1特異結(jié)合，而且可以很好地識(shí)別小麥籽粒中的WP1。已有研究顯示小麥種子中的可溶蛋白中包含多種過氧化物同工酶，而 WP1抗血清與種子總蛋白雜交時(shí)僅出現(xiàn)一條帶，證明其對(duì) WP1具有良好的專一性。

圖4 Western blotting檢測(cè)抗血清的特異性Fig. 4 Western blotting analysis the specificity of antiserum.(A) SDS-PAGE analysis. (B) Western blotting analysis. M:prestained protein marker; 1: the purified WP1 protein; 2, 3: the total soluble protein from wheat grain of Shan 225 and Zheng Nong16.

3 討論

制備抗體首先需要獲得高純度的目的蛋白。本研究將小麥WP1基因通過EcoRⅠ和Hind Ⅲ切點(diǎn)整合入pET28a載體，然后導(dǎo)入大腸桿菌T7 Expression菌株誘導(dǎo)表達(dá)。目的蛋白融合有 His標(biāo)簽，融合蛋白以包涵體形式存在。首先用裂解緩沖液反復(fù)洗滌除去可溶性蛋白，然后用含0.1% Triton X-100的裂解緩沖液洗滌去除膜蛋白，經(jīng)過上述方法獲得包涵體純度可達(dá)95%以上。為了獲得純度更高的重組蛋白，研究中使用尿素溶液溶解包涵體，然后使用Ni-NTA瓊脂糖親和介質(zhì)在變性條件下進(jìn)一步純化，最后獲得純度高于98%的重組WP1。蛋白質(zhì)是否變性是影響最終抗血清效價(jià)的重要因素。本研究制備的重組蛋白以變性形式溶解于8 mol/L尿素中，制備抗體時(shí)，首先將其逐級(jí)透析去除尿素，使目的蛋白最大程度復(fù)性，與佐劑等體積混合后免疫兔子，本研究獲得的抗血清效價(jià)高達(dá)1∶625 000。

抗體對(duì)抗原蛋白的專一性對(duì)抗體應(yīng)用非常重要。植物過氧化物酶是一個(gè)超家族，一個(gè)物種中通常存在幾十種到上百種過氧化物酶同工酶，如擬南芥全基因組中共有73個(gè)過氧化物酶基因[11]，水稻中共有138個(gè)過氧化物酶基因[12]。確定WP1多克隆抗體是否只與WP1特異反應(yīng)而不與其他過氧化物酶同工酶結(jié)合對(duì)WP1抗體的應(yīng)用非常關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中提取了小麥種子可溶性總蛋白，通過Western blotting檢測(cè)WP1多克隆抗體的專一性，結(jié)果只出現(xiàn)一條特異條帶，因而制備的WP1多克隆抗體具有非常好的特異性。這為利用該抗體進(jìn)行WP1的組織和細(xì)胞定位、分析不同小麥品種中WP1含量和加工性能關(guān)系等研究奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Hiraga S, Sasaki K, Ito H, et al. A large family of class III plant peroxidases. Plant Cell Physiol, 2001, 42(5):462–468.

[2] Wallace G, Fry SC. Action of diverse peroxidases and laccases on six cell wall-related phenolic compounds.Phytochemistry, 1999, 52(5): 769–773.

[3] Regalado C, García Almedárez BE, Duarte-Vázquez MA,et al. Biotechnological applications of peroxidases.Phytochem Rev, 2004, 3(1/2): 243–256.

[4] Oudgenoeg G, Hilhorst R, Piersma SR, et al. Peroxidasemediated cross-linking of a tyrosine containing peptide with ferulic acid. J Agric Food Chem, 2001, 49(5):2503?2510.

[5] Joye IJ, Lagrain B, Delcour JA, et al. Endogenous redox agents and enzymes that affect protein network formation during breadmaking -A review. J Cereal Sci, 2009, 50(1):1?10.

[6] Joye IJ, Lagrain B, Delcour JA. Use of chemical redox agents and exogenous enzymes, to modify the protein network during breadmaking -A review. J Cereal Sci,2009, 50(1): 11?21.

[7] Converso DA, Fernández ME. Peroxidase isozymes from wheat germ: purification and properties. Phytochemistry,1995, 40(5): 1341?1345.

[8] Caruso C, Chilosi G, Leonardi L, et al. A basic peroxidase from wheat kernel with antifungal activity.Phytochemistry, 2001, 58(5): 743?750.

[9] Yamashita H, Nanba Y, Onishi M, et al. Identification of a wheat allergen, Tri a Bd 36K, as a peroxidase. Biosci Biotech Biochem, 2002, 66(11): 2487?2490.

[10] Luo LH, Fan SH, Zhang MX, et al. Purification and characterization of peroxidase from wheat seed. J Agric Biotech, 2008, 16(1): 181?182.

羅龍海, 范三紅, 張美祥, 等. 小麥種子過氧化物酶的純化及其部分酶學(xué)性質(zhì). 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2008,16(1): 181?182.

[11] Tognolli M, Penel C, Greppin H, et al. Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana. Gene, 2002, 288(1/2): 129?138.

[12] Passardi F, Longet D, Penel C, et al. The class III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants. Phytochemistry, 2004, 65(13): 1879?1893.

Prokaryotic expression, purification and preparation of polyclonal antibody for wheat grain peroxidase WP1 gene

Liwei Shan1, Ruchun Tang1, Sanyang Liu1, Sanhong Fan1,2, and Aiguang Guo1,2

1 College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
2 Key Laboratory of Agricultural Molecular Biology in Shaanxi Province, Yangling 712100, China

Received: March 16, 2010; Accepted: May 20, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30300222).

Corresponding author: Sanhong Fan. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: sanhong.fan@gmail.com Aiguang Guo. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 30300222) 資助。

Received: April 12, 2010; Accepted: July 19, 2010

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A08).

Corresponding author: Baoan Cui. Tel/Fax: +86-371-63558878; E-mail: baoancui@henau.edu.cn

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃 (No. 2006BAD06A08) 資助。