鄧芳軼,包學(xué)才

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031;2.云南省臨滄市永德縣永康鎮(zhèn)紅旗山中學(xué),云南臨滄 677600)

佤族民間藥用動物紅螞蟻蛋白質(zhì)的提取方法改進(jìn)

鄧芳軼1,包學(xué)才2

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031;2.云南省臨滄市永德縣永康鎮(zhèn)紅旗山中學(xué),云南臨滄 677600)

以紅螞蟻為原料,采用單因素實驗法,分別用 3種鹽對紅螞蟻蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行了研究.結(jié)果表明,最適合的鹽是硫酸銨;最好的提取條件為:固液比 (w/v)=1∶10、鹽濃度為 1%、pH=4.0、抽提時間為 2 h,所得的蛋白質(zhì)提取率最高為為 36%,最低為 13%.

紅螞蟻;蛋白質(zhì);提取

紅螞蟻屬節(jié)肢動物門昆蟲綱 (Insecta)膜翅目(Hynencptera)蟻科 (For m icidae)動物,紅螞蟻是佤族民間藥用動物中的一種[1-3].實驗證明:紅螞蟻富含42%以上的特種昆蟲蛋白;有 28種氨基酸.其中人體所必需的 8種氨基酸齊全,并含有大量的維生素B、D等;還含有鋅、鎂、鈣、鐵、硒等多種人體必需的常量元素和微量元素;其中以鋅、錳的含量最高.此外還含有代謝過程中氧化所必需的輔酶 FAD、蟻酸以及人工無法合成的草體蟻醛等多種生物活性物質(zhì)[4-5].

佤族民間使用紅螞蟻來抗炎、鎮(zhèn)痛、護肝、平喘、鎮(zhèn)靜、解痙等,其補腎之功尤為顯著[6-7].臨床使用證明:紅螞蟻所富含的藥物成分,能直接參與機體的新陳代謝活動,增強或改善機體多種系統(tǒng)的功能,能有效地治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎、陽痿等虛損性疾病[8],佤族民間用紅螞蟻還因為它具有明顯的滋補、養(yǎng)顏、抗衰老、抗疲勞、增性欲、助睡眠、防脫發(fā)等保健作用[9].

1 材料與方法

1.1 材料

紅螞蟻:來源于云南省永德縣.

1.2 藥品與試劑

NaCl、KCl、(NH4)2SO4、CuSO4、NaOH、EDTA、HCl(天津市東升化學(xué)試劑廠);

1.3 主要儀器

TDL-60B低速大容量離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠制造;D36 mm透析袋 (MW:8000-14000、size:5M、進(jìn)口).

1.4 方法

1.4.1 鹽提蛋白法

蛋白質(zhì)可以溶于鹽溶液中,稱為鹽溶作用.離子強度較低的中性鹽溶液有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解,保護蛋白質(zhì)活性的作用,離子強度高則會引起蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析作用[11].

1.4.2 蛋白質(zhì)提取工藝流程

未處理的紅螞蟻→研磨→取樣調(diào)漿→加鹽抽提→離心分離 (去渣)→提取液加鹽到飽和→離心分離 (去下層清液)→含鹽蛋白 (4℃冷藏過夜)→透析得到去鹽蛋白→雙縮脲反應(yīng)鑒定[12]→干燥→產(chǎn)品.

1.4.3 實驗過程

1)最佳提取條件測定.每次稱取 1 g濕螞蟻于研缽中研磨成漿,分裝于 10 mL的離心管中,分別用NaCl、KCl、(NH4)2SO4按照表1的條件 ,根據(jù)上面設(shè)計的蛋白質(zhì)提取工藝流程,然后離心分離去除上清液,得去鹽蛋白,然后將去鹽蛋白干燥稱重,求出蛋白質(zhì)提取率.蛋白質(zhì)提取率 =去鹽蛋白的質(zhì)量 /濕螞蟻的質(zhì)量,結(jié)果見表1.

表1 紅螞蟻蛋白質(zhì)提取條件比較

2)蛋白質(zhì)的透析.蛋白質(zhì)是生物大分子物質(zhì),它不能透過透析膜,而小分子物質(zhì)可以自由透過.因此在分離提純蛋白質(zhì)的過程中,常利用透析的方法使蛋白質(zhì)與其中夾雜的小分子物質(zhì)分開.將上一步得到的含鹽蛋白質(zhì)溶液放入透析袋,袋兩端分別用夾子夾好,放入盛有蒸餾水的燒杯中透析,每 10 min換 1次蒸餾水.通過透析后,袋內(nèi)液含有蛋白質(zhì),而袋外液不含蛋白質(zhì).

3)蛋白質(zhì)的鑒定 (蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)).多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵,其結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同,因此,在堿性條件下銅離子也能夠呈現(xiàn)出類似于雙縮脲的紫紅色顯色反應(yīng)[13].取 4支試管分別加入 10 d蛋白質(zhì)透析后的透析袋內(nèi)液、袋外液、不透析液、蒸餾水 (對比),再分別加入 10 d 20%NaOH溶液和 4 d 0.1%CuSO4溶液,實驗結(jié)果見表2.

表2 蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

按 1.4的方法,離心管內(nèi)液體分層,上層為乳白色渾濁液,下層為透明溶液,而且用 (NH4)2SO4來提取的下層液最渾濁,用 NaCl來提取的次之,用KCl來提取的下層液最不渾濁,從表1也可以看出,用 (NH4)2SO4來提取蛋白質(zhì)提取率最高,可達(dá)36%;用 KCl來提取的提取率最低只有 13%.從雙縮脲反應(yīng)可以看出:經(jīng)透析后的產(chǎn)物含有蛋白質(zhì).從上述實驗結(jié)果可知,最有利于螞蟻蛋白質(zhì)提取的條件是:固液比 (w/v)=1∶10,鹽濃度為 1%,pH=4.0,抽提時間為 2 h;鹽析提取紅螞蟻蛋白質(zhì)最好的鹽是硫酸銨.

2.2 討論

2.2.1 固液比對提取效率的影響

在提取過程中固液比太小會因為蛋白質(zhì)的濃度太小而影響蛋白質(zhì)的提取,因為在多次提取中會有一定的損耗,影響提取的效果;若固液比過大,雖然提取的蛋白質(zhì)較多,但是在離心的過程中蛋白質(zhì)不能夠完全地被析出,對蛋白質(zhì)的完全提取有一定的影響.從實驗結(jié)果看,固液比 1∶10提取率最高.

2.2.2 鹽濃度對提取效率的影響

提取體系中利用無機鹽是為了增強提取體系的離子強度,因為被提取的蛋白質(zhì)為極性物質(zhì),離子強度越大,越容易被提取.但是蛋白質(zhì)又是一種膠體分子,離子強度過大會破壞蛋白質(zhì)分子的水化層,使蛋白質(zhì)發(fā)生沉降.實驗結(jié)果表明鹽濃度 1%較為合適.

2.2.3 pH值對提取效率的影響

體系中 pH值的選擇要盡量避開蛋白質(zhì)的等電點[14],經(jīng)實驗測得紅螞蟻蛋白質(zhì)的等電點為 5.0～6.5左右,通過實驗可知 pH=4較為合適.

2.2.4 抽提時間對提取效率的影響

由表1可知抽提時間太短,蛋白質(zhì)沒有完全被析出影響產(chǎn)品的數(shù)量,離心的時間太長蛋白質(zhì)會被破壞,從實驗結(jié)果看,抽提時間以 2 h提取率最高.

2.2.5 不同的鹽溶液對提取效率的影響

因為蛋白質(zhì)是親水膠體,借水化膜和同性電荷(在 pH值 7.0的溶液中一般蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性.向蛋白質(zhì)溶液中加入某種堿金屬或堿土金屬的中性鹽類 (如 (NH4)2SO4、KCl、NaCl或MgSO4等),則發(fā)生電荷中和現(xiàn)象 (失去電荷).當(dāng)鹽類的濃度足夠大時,蛋白質(zhì)膠粒脫水而沉淀,此蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)過透析或用水稀釋以減低或出去鹽后,能夠再溶解并且恢復(fù)其分子原有的結(jié)構(gòu)及生物活性,因此這樣得到的蛋白質(zhì)是有可逆性的[15].所以用氯化鈉、氯化鉀和硫酸銨 3種鹽溶液來提取蛋白質(zhì),實驗結(jié)果表明硫酸銨的效果最好,與 3種鹽溶液的離子強度有直接的相關(guān),從文獻(xiàn)得知,3種鹽中硫酸銨的離子強度最強,所以本實驗最終選擇了硫酸銨.

3 結(jié)語

蛋白質(zhì)是紅螞蟻的營養(yǎng)及藥用成分之一,國內(nèi)外對昆蟲蛋白質(zhì)主要采用非溶法提取,但存在著褪色、除臭及純化等較困難的問題[10].本實驗采用鹽提蛋白法 ,分別用 NaCl、KCl、(NH4)2SO43種鹽來提取云南佤族民間藥紅螞蟻蛋白質(zhì),并對提取效果進(jìn)行了系統(tǒng)比較,得到紅螞蟻蛋白質(zhì)的較好提取方法,此方法操作簡單,而且蛋白質(zhì)的提取效率高,適合實際生產(chǎn),為研究佤族民間藥紅螞蟻的營養(yǎng)及藥用成分及開發(fā)紅螞蟻類產(chǎn)品提供了參考.

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(責(zé)任編輯戴 云)

Wa Medicinal Animals in Yunnan Red Ant Protein Extraction Method

DENG Fang-yi1,BAO Xue-cai2
(1.School of Chemistry and Biotechnology,Yunnan University ofNationalities,Kunming 650031,China;2.Red Hill School of Yongde County of Yunnan Province,Lincang 677602,China)

Taking Tetramorium guineense Fabricius tested in three kindsof salt as the raw material and adopting the single factor testmethod,this research studied the effectsof different factorson the extraction of antprotein.The results showed that the optimum conditions included the following:the ratio of solid/liquidwas 1∶10,the salt concentration in the extractive reagentwas 2%,the pH was 4.0,and the time of centrifuge was 2 hours,the max imum protein extractwas 36%and the lowest 13%.

red ant;protein;extraction

Q 336

A

1672-8513(2011)01-0020-03

10.3969/j.issn.1672-8513.2011.01.005

2010-01-09.

鄧芳軼 (1970-),女,碩士,副教授.主要研究方向:生物技術(shù).