屈智慧,楊立志,趙 穎,肖慶飛,崔明姬

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一,是歐美國(guó)家導(dǎo)致終末期腎病的主要病因,其早期腎臟病理特征是腎臟肥大、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多。臨床早期表現(xiàn)為微量蛋白尿,繼之出現(xiàn)臨床蛋白尿,可致進(jìn)展性腎功能損害。其早期臨床標(biāo)志是白蛋白尿,而白蛋白尿的產(chǎn)生與一種近年來(lái)研究的足突裂孔蛋白nephrin表達(dá)減少有關(guān)。本研究觀察不同時(shí)期糖尿病大鼠尿白蛋白的排泄量與大鼠腎臟病理改變及Nephrin蛋白表達(dá)的相關(guān)系性,為進(jìn)一步研究糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只,購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量220±20 g,普通飼料喂養(yǎng),隨意飲水,攝食,室溫控制在25℃左右,濕度55%,12小時(shí)交替照明。

1.2 動(dòng)物模型制作與分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為正常組(NC)與糖尿病模型組(DM),每組大鼠20只。造模前禁食12小時(shí)(不禁水),將鏈脲菌素(STZ)溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液,pH4.2,按50 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射,每日監(jiān)測(cè)尿糖,3天后采尾靜脈血測(cè)血糖濃度大于16.7 mmol/L,尿糖陽(yáng)性,確定為糖尿病模型形成。正常組給予等體積的枸櫞酸緩沖液一次性腹腔注射。

1.3 標(biāo)本的采集 分別于0周、4周、8周、12周(各周均指造模成功后的各周末)從NC組與DM組各隨機(jī)取大鼠5只處死,處死前稱體重后置入代謝籠中收集24小時(shí)尿液,計(jì)尿液總量后取10ml離心,取上清液于-20℃冰箱保存待測(cè)。留尿后用乙醚麻醉大鼠,剪尾測(cè)血糖,摘眼球取血,離心后取血清-20℃冰箱保存,用于血肌酐、尿素氮的檢測(cè)。取血后頸椎離斷處死大鼠,迅速取出腎臟,右腎去除包膜,生理鹽水洗去血跡后稱重,用于計(jì)算腎重/體重指數(shù)(KW/BW)。左腎縱向切開(kāi),部分標(biāo)本用4%多聚甲醛固定48小時(shí),常規(guī)制備石蠟切片。連續(xù)切片厚3-4 μ m,做常規(guī)HE染色與PAS染色,以及免疫組化染色,光鏡觀察。

1.4 指標(biāo)的檢測(cè) 免疫比濁法檢測(cè)24 h尿白蛋白量。采用Beckman全自動(dòng)生化儀測(cè)定大鼠血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr),尿肌酐(Ucr),計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr),Ccr(ml/min.kg)=Ucr(mg/dl)x每分鐘尿量(ml/min)/Scr(mg/dl)/體重(kg)。

1.5 腎組織病理檢查 標(biāo)本用4%多聚甲醛固定48 h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,連續(xù)切片厚3-4 μ m,PAS染色光鏡觀察。

1.6 腎組織nephrin蛋白免疫組化表達(dá) 首先采用SP法,石蠟切片脫蠟水化后,微波修復(fù)抗原,3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS洗滌,正常血清封閉非特異性抗原,依次加入一抗山羊抗鼠nephrin多克隆抗體(1∶100,美國(guó)Santa Cruz),二抗為滴加生物素化兔抗山羊IgG二抗(福州邁新),DAB顯色,蘇木精復(fù)染,封片,鏡檢。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照染色。采用HMIAS2000高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng),在高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)完整腎小球,以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào),分別測(cè)量出每個(gè)腎小球陽(yáng)性區(qū)面積、陽(yáng)性區(qū)積分光密度,二者相除后得陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度值(IOD),再取IOD均值進(jìn)行免疫組化的半定量分析,代表樣本相對(duì)陽(yáng)性表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時(shí)期體重、腎重/體重指數(shù)、24小時(shí)尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化

0周時(shí)兩組大鼠體重?zé)o差異,實(shí)驗(yàn)期間NC組體重較DM組增長(zhǎng)迅速,4周起兩組體重在各周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DM組大鼠腎重/體重指數(shù)第4周起,與NC組比較均有增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DM組4周后尿白蛋白開(kāi)始增加,與同期NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),至12周時(shí),DM組尿白蛋白與同期NC組比較差異更加明顯(P＜0.01);0周時(shí)兩組大鼠肌酐清除率無(wú)差異,第8周時(shí)DM組大鼠肌酐清除率增高明顯,與同期NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但12周時(shí)DM組大鼠肌酐清除率較8周時(shí)有所下降,考慮與腎臟損傷加重有關(guān)。(見(jiàn)表1)。

表1 兩組大鼠不同時(shí)期體重、腎重/體重指數(shù)、尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化(±s)

表1 兩組大鼠不同時(shí)期體重、腎重/體重指數(shù)、尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化(±s)

注:與同期NC組比較,*P＜0.05,▲P＜0.01

組別 時(shí)間(W) 鼠數(shù)(n) 體重(g) 腎重/體重指數(shù)(‰) 尿白蛋白(mg/24 h) Ccr(ml?min-1100 g-1)NC組 0 5 223.2±15.6 3.67±0.22 4.37±0.53 0.67±0.15 4 5 275.3±18.2 3.44±0.26 4.72±1.01 0.68±0.20 8 5 311.7±24.9 3.81±0.37 5.65±0.73 0.66±0.17 12 5 373.4±38.2 4.22±0.32 6.46±1.84 0.70±0.23 DM組 0 5 226.1±12.7 3.52±0.20 4.16±0.72 0.71±0.14 4 5 247.6±13.5* 5.07±0.29* 7.28±1.76* 0.74±0.18 8 5 278.3±20.4* 5.99±0.61* 9.77±2.11* 0.98±0.21*12 5 297.4±53.2* 7.58±1.03* 15.98±2.49▲ 0.83±0.38

2.2 腎組織病理光鏡檢查結(jié)果

光鏡PAS染色顯示,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NC組大鼠腎臟組織均未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。DM組第4周末時(shí),較NC組及本組0周比較腎小球體積增大,系膜區(qū)輕度增寬,第8周末腎小球系膜基質(zhì)增多,系膜細(xì)胞明顯增多,基底膜增厚,第12周伴有基底膜彌漫增厚,毛細(xì)血管塌陷明顯。(見(jiàn)圖1)。

2.3 腎組織nephrin蛋白的表達(dá)

NC組不同時(shí)間大鼠腎組織nephrin表達(dá)均勻分布于腎小球毛細(xì)血管袢,可見(jiàn)棕黃色的nephrin沿基膜呈線形分布。DM組大鼠腎組織nephrin表達(dá)從第8周開(kāi)始不如0周及4周均勻,染色強(qiáng)度減弱,棕黃色線樣沉積逐漸變細(xì)、變淡,第12周時(shí)褪色更加明顯。同時(shí)測(cè)定陽(yáng)性區(qū)腎組織nephrin蛋白的表達(dá)量DM組大鼠第8周時(shí)較0周、4周降低,第12周時(shí)降低更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),而NC組大鼠不同時(shí)期均無(wú)變化。(見(jiàn)圖2,表3)。

表3 兩組大鼠不同時(shí)期腎小球nephrin蛋白免疫組化表達(dá)量的比較(±s)

表3 兩組大鼠不同時(shí)期腎小球nephrin蛋白免疫組化表達(dá)量的比較(±s)

注:與本組0周比較,*P＜0.05,▲P＜0.01;

組別 0周 4周 8周 12周NC組 35.26±1.73 37.01±2.11 34.88±2.24 38.47±2.59 DM 組 36.55±1.62 31.79±2.03 24.10±1.85*20.21±1.96▲

3 討論

近年來(lái)隨著糖尿病發(fā)病率的逐漸增高,對(duì)糖尿病腎病的研究也倍受重視,尤其是糖尿病腎病早期白蛋白尿的產(chǎn)生與作用機(jī)制。Lin等[1]研究證明DN蛋白尿進(jìn)展的兩個(gè)關(guān)鍵因素是足細(xì)胞數(shù)量的減少及足細(xì)胞裂孔蛋白 nephrin的減少。Nephrin蛋白是1998年瑞典教授Karl Tryggvason在研究先天性腎病綜合征芬蘭型時(shí)發(fā)現(xiàn)的,它是腎小球?yàn)V過(guò)屏障上皮細(xì)胞足突之間裂孔隔膜上第一個(gè)被確定的蛋白[2-3]。其在足突裂孔膜處形成“拉鏈樣結(jié)構(gòu)”,它的缺失或氨基酸序列的改變,會(huì)導(dǎo)致裂孔膜的破壞,進(jìn)而產(chǎn)生大量尿蛋白[4]。

糖尿病不同時(shí)期蛋白尿的排泄量及其與nephrin蛋白表達(dá)異常關(guān)系的研究結(jié)果也不盡相同。Doublier等[5]證實(shí)糖尿病早期腎小球nephrin蛋白減少,說(shuō)明nephrin是糖尿病早期腎臟損傷的標(biāo)志物。Aaltonen[6]等利用PCR檢測(cè)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中nephrin mRNA的表達(dá),顯示第4周nephrin mRNA平均上調(diào)50%,這種趨勢(shì)一直持續(xù)到16周。Bonnet[7]用RT-PCR與免疫組化的方法研究糖尿病自發(fā)高血壓小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著蛋白尿的出現(xiàn),腎組織中nephrin mRNA的含量減少,免疫組化染色亦減退。

本研究中發(fā)現(xiàn),DM組第4周時(shí)尿白蛋白排泄量開(kāi)始增加,大鼠腎重/體重指數(shù)同步增加,而肌酐清除率第8周時(shí)有明顯增高,說(shuō)明尿白蛋白的改變?cè)缬谀I功能的改變,白蛋白尿是糖尿病早期腎損害的標(biāo)志。肌酐清除率第12周時(shí)有所下降,說(shuō)明隨著糖尿病病程的延長(zhǎng),尿蛋白排泄率不斷增加導(dǎo)致腎臟損傷加重。腎組織病理光鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4周時(shí)只有腎小球體積增大,系膜區(qū)輕度增寬,第8周時(shí)腎小球系膜基質(zhì)增多,系膜細(xì)胞明顯增多,基底膜增厚,待第12周時(shí)出現(xiàn)基底膜彌漫增厚,毛細(xì)血管塌陷明顯。DM組大鼠腎組織nephrin表達(dá)從第8周開(kāi)始不如0周及4周均勻,染色強(qiáng)度減弱,棕黃色線樣沉積逐漸變細(xì)、變淡,第12周時(shí)褪色更加明顯。同時(shí)測(cè)定陽(yáng)性區(qū)腎組織nephrin蛋白的表達(dá)量DM組大鼠第8周時(shí)較0周、4周降低,第12周時(shí)降低更加明顯,而NC組大鼠不同時(shí)期均無(wú)此變化。說(shuō)明糖尿病腎病臨床早期出現(xiàn)微量蛋白尿,繼之出現(xiàn)臨床蛋白尿,最終進(jìn)展至腎功能損害,這一系列改變與足細(xì)胞裂孔蛋白nephrin的表達(dá)有相關(guān)性。

總之,我們認(rèn)為糖尿病大鼠隨著糖尿病病程的延長(zhǎng),尿蛋白排泄率不斷增加與腎臟病理?yè)p傷的嚴(yán)重程度有關(guān),且與腎組織nephrin的表達(dá)相關(guān),足細(xì)胞裂孔蛋白nephrin是糖尿病腎損傷的早期標(biāo)志。應(yīng)該更加深入定量研究nephrin蛋白在糖尿病不同時(shí)期的作用,為降低糖尿病腎病的發(fā)生率開(kāi)辟一個(gè)新的道路。

[1]Lin CL,Wang FS,Hsu YC,et al.Modulation of Notch-1 signaling alleviates VEGF-mediated diabetic nephropathy[J].Diabetes,2010,59:1561.

[2]Tryggvason,K.Unraveling the mechanisms of glomerular ultrafiltration:nephrin,a key component of the slit diaphragm[J].J Am Soc Nephrol,1999,10:2440.

[3]Wickelgren I.First component found for new kidney filter[J].Science,1999,286:225.

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[5]Doublier S,Salvidio G,Lupia E,et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin II[J].Diabete,2003,52:1023.

[6]Aaltonen P,Luimula P,Astrom E et al.Changes in the expreesion of nephringene and protein in experimental diabetic nephropathy[J].Lab Invest,2001,81:1185.

[7]Bonnet F,Cooper ME,Kawachi H,et al.Irbesartan normalises the deficiency in glomerular nephrin expression in a model of diabetes and hypertension[J].Diabetologia,2001,44(7):874.