劉聲茂,崔英春,田向輝,顧 華,吳 曼,劉慶鑫,張冬梅*

(1.吉林大學第二醫(yī)院腎病內科,吉林長春130041;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院腎病科)

胰淀素(amylin)是胰島β細胞分泌的一種由37個氨基酸殘基組成的神經肽樣分子,是近年來被確認的一種具有生理活性的胰島激素。有學者報道[1],約70%-90%的2型糖尿病患者存在胰島淀粉樣變性,其沉積物的主要成分為amylin。糖尿病腎病(DN)患者存在amylin表達、分泌異常,導致其外周血中amylin水平增高,并在腎臟沉積引起腎損傷[2]。其致病機制為DN患者體內胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)所致的高胰島素血癥和高amylin血癥,可以導致amylin在腎小球沉積,成為腎小球結節(jié)樣病變的病因之一,此外,amylin還可以誘導系膜細胞凋亡加重局部組織損傷和纖維化的形成。肥胖相關性腎病(Obesity-related glomerulopathy,ORG)也伴有IR,也會出現高胰島素血癥和高amylin血癥,是否可以導致amylin在腎小球的沉積,誘發(fā)腎臟損傷,目前尚未見這方面的報道。本實驗采用臨床觀察結合動物實驗的方法,旨在探討amylin在ORG進展中作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人血清Amylin-ELISA試劑盒及大鼠Amylin-ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司);兔抗人Amylin單克隆抗體、兔抗大鼠Amylin單克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG及免疫組化試劑盒(Sigma公司);注射用大鼠Amylin(Sigma公司)。

1.2 臨床觀察對象及分組

結合臨床,經腎穿刺活檢腎臟病理明確診斷為ORG的患者為觀察組(ORG組,14例),隨機選取腎穿刺活檢病理明確診斷為系膜增生性腎小球腎炎的患者為對照組(NC組,14例)。所有患者24小時尿蛋白定量＜2.0 g,血肌酐＜200 μ mol/L,均無心 、肝 、腎等疾病史及糖尿病家族史,無急慢性感染及其他自身免疫性疾病,空腹及餐后2小時血糖正常。

1.3 動物實驗模型制作及分組

成年雄性Wistar大鼠30只,體重為(200±20)g,適應性喂養(yǎng)3天,隨機分為3組:正常對照組(NC組,n=10)、肥胖相關性腎病組(ORG組,n=10)和amylin皮下注射組(Amylin組,n=10)。根據文獻建立ORG大鼠模型[3],ORG組和Amylin組大鼠給予高脂飼料(脂肪49%,蛋白21%,碳水化合物30%,鹽2%;其中普通飼料59%,熟豬油20%,雞蛋黃10%,蔗糖9.5%和食鹽1.5%,熱卡21 kJ/g),NC組給予普通飼料,自由攝食,自由飲水。ORG組和Amylin組大鼠在飼養(yǎng)2個月后用尿蛋白試紙檢測尿蛋白,出現尿蛋白即為ORG模型成功。ORG模型成功后,Amylin組大鼠給予大鼠amylin皮下注射(100 μ g/kg)[4],隔日1次,持續(xù)2個月。NC組和ORG 組大鼠給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

1.4 標本采集

1.4.1 臨床標本采集 全部研究對象均抽取非抗凝的靜脈血4 ml,留取血清;抗凝血4 ml留取血漿;調取兩組患者腎臟病理標本蠟塊,制成免疫組化所需標本切片備用。

1.4.2 動物實驗標本采集 6個月時各組大鼠用代謝籠留取24 h尿,檢測24 h尿蛋白定量。乙醚麻醉下稱體重,測量體長即鼻至肛門的長度。心臟取血,3 000 rpm離心10min,分離血清,-70℃保存。迅速開腹取出左腎,去掉被膜,經腎門冠狀面取腎組織,置于新配制的10%中性緩沖甲醛液固定,用于光鏡觀察及免疫組化檢測。

1.5 各項指標的檢測

1.5.1 患者及大鼠24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)檢測:考斯亮藍方法檢測。

1.5.2 患者及大鼠血清學指標檢測 采用ELISA法檢測血清amylin水平;放射免疫法檢測胰島素水平;自動生化分析儀測定血糖(SG)、血脂(TG,TC)。1.5.3 患者及大鼠胰島素抵抗指數(HOMA-IR)計算:空腹血糖×空腹胰島素含量/22.5。

1.5.4 患者及大鼠免疫組化ABC法檢測 腎組織切片3 μ m,常規(guī)脫蠟至水,加入兔抗大鼠amylin單克隆抗體/兔抗人amylin單克隆抗體(1∶100稀釋),再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀釋),DAB顯色,蘇木素復染細胞核,封片觀察。

1.5.5 大鼠Lee's指數的計算 Lee's指數=[體重(g)]1/3×103/體長(cm)。

1.6 統(tǒng)計學分析

用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行分析,數據以均數±標準差(±s)表示。兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床觀察結果

2.1.1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量 與NC組比較,ORG組患者的SG增高,差異無顯著性,TC、TG、HOMA-IR及amylin水平均明顯增高,差異具有顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

表1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

▲▲P＜0.01 vs NC組

n SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L)NC 組 14 4.96±0.41 1.03±0.30 3.92±0.61 2.63±0.69 381.27±99.14 ORG組 14 5.19±0.65 2.40±0.67▲▲ 5.58±0.94▲▲ 7.95±2.77▲▲ 498.98±105.44▲▲

2.1.2 兩組患者腎臟amylin表達情況 NC組患者腎小球內無明顯amylin表達;ORG組患者腎小球內擴張的系膜區(qū)可見陽性表達。見圖1。

2.2 動物實驗結果

2.2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 第1個月內ORG組和Amylin組大鼠進食量減少,飲水明顯增加,行動遲緩,活動量減少;1個半月后ORG組和Amylin組大鼠上述情況均好轉;6個月時ORG組和Amylin組大鼠飲水和尿量均明顯增多,毛發(fā)光亮度減退,活動減少,精神出現不同程度的萎靡。NC組大鼠均正常。

2.2.2 大鼠Lee's指數 分組時各組大鼠Lee's指數比較無統(tǒng)計學差異,6個月實驗結束時,ORG組和Amylin組Lee's指數顯著高于NC組(P＜0.01),ORG組和Amylin組兩組間無顯著差異(P＞0.05),見表2。

圖1 兩組患者腎臟amylin表達,ABC法,400×,A為NC組,B為ORG組

2.2.3 各組大鼠SG 、TC 、TG 、HOMA-IR、amylin 水平及24小時尿蛋白定量的變化 與NC組比較,ORG組和Amylin組大鼠的SG、TG、TC、HOMA-IR 和24 h-PRO均增高,其中ORG組的TC和24h-PRO差異具有顯著性(P＜0.05),Amylin組除SG外,其余各指標差異均具有顯著性(P＜0.01),但兩組SG雖升高,均在正常范圍內且差異無顯著性;與ORG組比較,Amylin組除SG和HOMA-IR外,其余各指標差異均具有顯著性(P＜0.01)。見表3。

表2 各組大鼠Lee's指數值

表3 各組大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗指數、胰淀素水平及24小時尿蛋白定量的變化(±s)

表3 各組大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗指數、胰淀素水平及24小時尿蛋白定量的變化(±s)

▲P＜0.05 vs NC組,▲▲P＜0.01 vs NC組,**P＜0.01 vs ORG組

SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L) 24 h-PRO(g/24 h)NC組 6.38±3.63 1.60±0.30 0.43±0.18 6.80±4.05 231.77±11.69 0.35±0.09 ORG組 7.75±1.80 1.74±0.19 1.30±0.25▲ 9.36±1.09 232.10±12.59 1.43±0.02▲Amylin組 9.57±2.64 5.83±0.32▲▲**5.37±0.19▲▲**11.93±3.70▲▲ 254.34±31.96▲▲** 1.91±0.45▲▲**

3 討論

胰淀素是胰島β細胞分泌的一種由37個氨基酸殘基組成的神經肽樣分子,與胰島素(Ins)共同存在于胰島細胞分泌囊泡中,生理狀態(tài)下胰淀素參與體內代謝,與胰島素拮抗來維持人體的正常功能,而人體內胰淀素分泌異常將導致代謝紊亂,出現IR。與此同時,代謝的紊亂又進一步導致胰淀素的異常分泌。因此,胰淀素與IR是互為因果的。當amylin表達、分泌異常時,形成胰島淀粉樣蛋白,沉積在胰島細胞內及其周圍,對胰島β細胞有細胞毒性作用,使胰島β細胞團及胰島素分泌減少,導致β細胞功能障礙和部分胰島β細胞的喪失,從而導致胰島β細胞功能進行性衰退[5],并且還誘發(fā)及加重IR[6];促進脂肪分解,增加血游離脂肪酸水平[7];活化腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)[8]和活化糖基化終末產物受體,刺激炎癥反應發(fā)生[7,8],進而參與糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)生?，F已經有研究證實,amylin參與糖尿病及DN的發(fā)生發(fā)展,結果[9]顯示DN患者腎組織中有amylin沉積,并主要沉積在腎小球系膜區(qū)、K-W結節(jié)、增厚的球囊壁和病變的血管壁,腎組織amylin的沉積可能參與了DN患者的腎損傷。而ORG與糖尿病及DN有相似的發(fā)病機制及遺傳背景,故我們有針對性的選擇經臨床及病理明確診斷為ORG的患者進行觀察,免疫組化染色觀察后發(fā)現,在ORG患者腎臟亦有表達,為進一步確定amylin在ORG發(fā)生發(fā)展中的作用是否與參與DN的機制相同,我們采用ORG模型大鼠給予皮下注射amylin,結果發(fā)現,amylin注射后各項生化指標均增加,差異顯著,且amylin在腎臟的表達亦增加,說明amylin有促進ORG病情惡化的作用。由此,我們可以得出以下結論,即amylin在ORG發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,與在DN中產生的結果相同,其次,amylin可能有望成為ORG的治療靶點,有效的延緩病情的進展。

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