張陽東,溫新宇,董 矜,楚瑞雪,田亞平*

(1.解放軍第二炮兵總醫(yī)院 檢驗(yàn)科,北京100088;2.解放軍總醫(yī)院 生化科,北京100853;3.解放軍第二炮兵禮士路門診部,北京100820)

近年來,隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變,冠心病(CAD)已成為當(dāng)今危害我國人民健康和生命的主要疾病。CAD的基因機(jī)制及基因檢測在CAD診斷中的應(yīng)用研究日益受到重視。單核苷酸的多態(tài)性(SNP)造成了人類在疾病易感性等方面的不同。SNP的基因型頻率、等位基因頻率及單倍體型頻率都可能與疾病相關(guān)。標(biāo)簽SNP是指能代表一個染色體區(qū)域其他眾多位點(diǎn)信息的SNP位點(diǎn)。檢測SNP進(jìn)行疾病的相關(guān)性分析,可以從遺傳的角度將疾病的基因診斷提高到單堿基水平。本研究通過提取人體外周血中白細(xì)胞的DNA,根據(jù)文獻(xiàn)及國際單倍型圖工程數(shù)據(jù)庫(Hapmap,http://www.hapmap.org)檢索,選擇中國漢族人群CAD相關(guān)基因內(nèi)收蛋白1(ADD1),血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(PECAM-1),C-反應(yīng)蛋白(CRP),內(nèi)皮固有型一氧化氮合酶(ecNOS),漿細(xì)胞膜糖蛋白1(PC-1),L-選擇素(SELL),G蛋白β亞單位(GNB3),血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE),血管緊張素II 1型受體(AT1R),血管緊張素原(AGT),細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1),亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和肝脂肪酶基因(HL)等13個基因的44個標(biāo)簽SNP,設(shè)計合成引物,應(yīng)用SNP Stream基因分型系統(tǒng)構(gòu)建檢測多重SNP的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 AG型PCR儀購自德國Eppendorf公司。SNP Stream基因分型系統(tǒng)購自美國Beckman Coulter公司。多重SNP檢測實(shí)驗(yàn)所用dNTP購自日本TaKaRa公司,PCR緩沖液、氯化鎂、Gold Taq酶購自瑞士Roche公司,外切酶Ⅰ購自新英格蘭BioLabs公司,蝦鹼性磷酸酶及其緩沖液、滅菌雙蒸水購自美國Promega公司,余試劑購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 PCR引物的設(shè)計和合成 實(shí)驗(yàn)相關(guān)的基因名稱、編碼,SNP編碼及突變類型見表1。

表1 SNP相關(guān)的基因、突變類型及樣本檢出率

應(yīng)用美國Beckman Coulter公司的AP Editor軟件,在www.autoprimer.com上在線完成引物設(shè)計并由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。每個SNP共設(shè)計3個引物,其中2個為PCR擴(kuò)增引物,用于擴(kuò)增出含有目的SNP位點(diǎn)的片斷;1個為延伸引物,用于SNP位點(diǎn)的測序及與玻璃芯片上的寡核苷酸鏈雜交。SNP的PCR引物及延伸引物堿基序列見表2。

表2 SNP引物堿基序列

接上表

接上表

1.3 多重PCR擴(kuò)增及純化 用滅菌雙蒸水將樣品DNA稀釋到2-10 ng/μ l。稀釋并混合PCR引物使其終濃度為2.5μ M,稀釋并混合延伸引物使其終濃度為5 μ M。96孔板的每個反應(yīng)孔中加入由引物,dNTP,緩沖液,氯化鎂,Taq酶和滅菌雙蒸水構(gòu)成的反應(yīng)液3 μ l,對應(yīng)每孔內(nèi)加入稀釋后的樣品DNA 2 μ l,PCR總反應(yīng)體積為 5 μ l。擴(kuò)增條件:94℃變性1 min,然后進(jìn)入40次循環(huán)(94℃變性30 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸1 min),最后25℃保溫10 min。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μ l由外切酶Ⅰ、蝦鹼性磷酸酶和滅菌雙蒸水配制的純化液。純化反應(yīng)條件:37℃30 min,96℃10 min,25℃10 min。

1.4 延伸 每個反應(yīng)孔中加入7 μ l由延伸緩沖液,混合延伸引物,熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸T/C和A/G,DNA聚合酶和滅菌雙蒸水配制的延伸液。延伸反應(yīng)條件:96℃3 min,進(jìn)入40次循環(huán)(94℃20 sec,40℃11 sec),25℃保溫10 min。

1.5 洗板 吸取20倍稀釋后的沖洗緩沖液1(20X Wash Buffer 1)20 μ l加入到雜交板上的每個孔中,將雜交板翻過來放在無塵紙上,一起放在離心機(jī)的托盤內(nèi)進(jìn)行離心,使雜交板上每個孔中的清洗液全部脫離,離心速度為 1 000 RCF(2 665 r/min),每次離心1 min,一共洗滌3次。

1.6 雜交 在延伸產(chǎn)物中加入8 μ l雜交液,混勻后取15 μ l加入雜交板反應(yīng)孔中,42℃雜交 2 h。1 000 RCF離心甩干。吸取20倍稀釋后的沖洗緩沖液2(60X Wash Buffer 2)20 μ l加入到雜交板上的每個孔中,離心甩干,一共清洗3次。

1.7 掃描 在SNPstream V2.2軟件中輸入與雜交板每個反應(yīng)孔對應(yīng)的樣品信息,導(dǎo)入引物位點(diǎn)文件并建板,掃描雜交板后通過該軟件分析掃描信號,校正偏離位點(diǎn),調(diào)整基因型的邊界線并導(dǎo)出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SNP的結(jié)果掃描分析 延伸反應(yīng)中SNP位點(diǎn)結(jié)合上熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸T(藍(lán)色)/C(綠色)和A(藍(lán)色)/G(綠色)后,通過雜交,經(jīng)SNP Stream基因分型系統(tǒng)掃描,可以獲得三種顏色的掃描結(jié)果,即純合型的藍(lán)色(B)或綠色(G),雜合型的橙色。實(shí)驗(yàn)中每份標(biāo)本均設(shè)有1個陰性,2個純合型,1個雜合型共4個質(zhì)控對照點(diǎn)。掃描圖的橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度相對值B/(B+G),縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度對數(shù)值。圖1所示5個掃描圖依次為陰性質(zhì)控位點(diǎn),純合XX型質(zhì)控位點(diǎn),雜合XY型質(zhì)控位點(diǎn),純合YY型質(zhì)控位點(diǎn)和標(biāo)本的SNP掃描結(jié)果。

圖1 SNP的掃描結(jié)果

2.2 反應(yīng)體系中SNP的檢出率 反應(yīng)體系由13個基因共44個SNP組成。通過對583份DNA標(biāo)本進(jìn)行檢測,共獲得12個基因32個SNP的基因分型結(jié)果,基因分型的成功率為72.7%。而分型成功的32個SNP的平均樣本檢出率為98.3%。SNP的樣本檢出率見表1。

3 討論

目前SNP的檢測方法主要有測序、高效液相色譜、限制性酶切、基因芯片和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)等[1-3]。這些方法只能檢測一個或少數(shù)幾個SNP,不適合多個SNP、多種類型SNP和大批量標(biāo)本的檢測。

美國Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統(tǒng)是一套高自動化、高通量的SNP基因分型系統(tǒng)。它將多重PCR技術(shù)與熒光標(biāo)記單堿基延伸分型技術(shù)結(jié)合起來。其基本原理是單堿基延伸和標(biāo)簽微陣列。單堿基延伸法又稱微測序法,是在雙脫氧測序法的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的SNP檢測方法。首先用PCR的方法從基因組DNA中擴(kuò)增出含有目的SNP位點(diǎn)的片斷,用一條與SNP位點(diǎn)上游序列相匹配的引物進(jìn)行“測序反應(yīng)”,并在反應(yīng)中加入熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸,使得這個“測序反應(yīng)”在測出SNP位點(diǎn)的堿基后便終止了。雖然該方法基于測序原理,但由于只需測一個堿基,因而極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)同時引入標(biāo)簽微陣列芯片雜交技術(shù),將寡核苷酸微陣列技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)的384孔板內(nèi)。標(biāo)簽微陣列是在玻璃芯片板的板底預(yù)先合成上幾十條交叉雜交率最低、與數(shù)據(jù)庫中各種基因組同源性極小,并能提供很強(qiáng)信號的單鏈寡核苷酸鏈(標(biāo)簽),與這些標(biāo)簽互補(bǔ)的帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈能通過雜交結(jié)合上去,然后掃描檢測其熒光標(biāo)記。結(jié)果由成像儀根據(jù)標(biāo)記的雙脫氧核苷酸的雙色熒光讀出,根據(jù)標(biāo)簽標(biāo)記的熒光不同,從而將與標(biāo)簽互補(bǔ)的不同寡核苷酸鏈區(qū)別開。該系統(tǒng)不需要新的設(shè)備和試劑,只需要稍微改變實(shí)驗(yàn)方法,就可以在同一實(shí)驗(yàn)體系中同時對4種類型多至48個SNP位點(diǎn)進(jìn)行大批量樣本快速檢測。目前該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于大樣本多SNP位點(diǎn)的檢測[4-6]。

本研究應(yīng)用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統(tǒng),在構(gòu)建CAD相關(guān)基因多重SNP分型檢測法的實(shí)驗(yàn)體系中共設(shè)計44個SNP的基因分型。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2 ng的DNA就足夠進(jìn)行44重SNP的檢測,即每個SNP位點(diǎn)只需要0.045 ng的DNA。由于不同基因擴(kuò)增反應(yīng)間引物的競爭及引物的融解溫度存在差異等影響因素,本實(shí)驗(yàn)共獲得32個SNP的基因分型結(jié)果,基因分型的成功率為72.7%(32/44)。通過對583份DNA標(biāo)本進(jìn)行檢測,分型成功的32個SNP的平均樣本檢出率為98.3%。32個SNP包括C/T,A/G,G/T和A/C四種類型,每一類型均有較高的檢出率。總之,我們應(yīng)用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系統(tǒng)構(gòu)建的32重SNP基因分型方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量、操作簡單、微量化并可同時檢測最多4種SNP類型等優(yōu)點(diǎn)。

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