張 恒,王月英,吳紅英,李德冠,王小春,路 璐,常建輝,翟志斌,孟愛民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300192)

再生障礙性貧血(Aplastic Anemia,AA再障),系多種病因引起的造血障礙,導(dǎo)致紅骨髓總?cè)萘繙p少,造血衰竭,全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征[1]。其發(fā)病機(jī)制除與造血干細(xì)胞本身缺陷、造血微環(huán)境損傷有關(guān)外,免疫功能是再障重要的發(fā)病原因。對AA臨床患者研究表明[2,3],AA患者外周血CD4+細(xì)胞比例降低,CD8+細(xì)胞比例升高,CD4+/CD8+比值失調(diào);此外T細(xì)胞活化相關(guān)的共刺激分子CD40、B7(CD80/CD86)等也參與了AA的發(fā)病過程,并對患者預(yù)后有重要影響。

AA動物模型構(gòu)建方法有物理方法、化學(xué)方法、免疫介導(dǎo)方法和混合方法。評估指標(biāo)主要包括,全血細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞減少,骨髓象三系血細(xì)胞減少[1,4];但目前還未見對AA動物模型的免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評價。開展對AA動物模型免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)的評估,有利于對AA動物模型有效性的科學(xué)評價,有利于評估新療法在患者免疫學(xué)指標(biāo)的改善。在我們的研究中,我們參照了Barnes等的報道[5],采用電離輻射和免疫介導(dǎo)結(jié)合的方法誘導(dǎo)小鼠AA模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 近交系DBA/2小鼠2只,22-24 g,雄性,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供(合格證號:SCXK(京)2005-0013)。近交系BALB/C小鼠30只,20-22 g,雄性,由中國輻射防護(hù)研究院提供(動物許可證編號:SCXK(京)2007-0001)。全價清潔飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 試劑 Anti-Mouse TER-119(ly-76)-biotin、Anti-Mouse Ly-6G(Gr-1)、Anti-Mouse CD11b、Anti-Mouse CD5(Ly-1)、Anti-Mouse CD45R(B220)、Anti-Mouse CD4-FITC、Anti-Mouse CD8-PE、Anti-Mouse CD40-FITC 、Anti-Mouse CD80-FITC 、Anti-Mouse CD86-PE,以及鼠IgG1-PE、IgG1-FITC均eBioscience產(chǎn)品。

1.3 照射條件 天津市物理技術(shù)研究所60Co源γ射線,劑量為5.0Gy,劑量率為1.1Gy/min。

1.4 動物模型建立方法

1.4.1 動物分組 取生長良好的BALB/C小鼠30只,隨機(jī)分為 3組,每組10只,即對照組、照射組、AA模型組。對照組進(jìn)行假照射,照射組和AA模型組進(jìn)行照射。

1.4.2 AA動物模型制備 將DBA/2小鼠(供鼠)頸椎脫臼法處死,常規(guī)消毒后,在超凈工作臺中無菌取出胸腺,置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,除去粘附的結(jié)締組織、剪碎、輕磨、200目不銹鋼網(wǎng)過濾,制成單細(xì)胞懸液,臺盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性(在95%以上),計(jì)數(shù)后用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml備用。BALB/c小鼠經(jīng)5.0 Gy劑量60Co源γ射線全身照射,4 h后經(jīng)尾靜脈輸人DBA/2小鼠的胸腺細(xì)胞懸液0.2 ml/只,含細(xì)胞數(shù)為1×106個,建立AA小鼠模型10只。對照組和照射對照組尾靜脈注入等量的 RPMI-1640培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)第15日檢測各項(xiàng)指標(biāo)評估動物模型是否成功構(gòu)建。

1.5 評價實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 外周血常規(guī)指標(biāo)測定 模型制備至第15日,小鼠眼球取血200μ l,EDTA-K3抗凝,用自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(pocH-100i,希森美康,日本)測定外周血白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板(PLT)等指標(biāo);取抗凝血100μ l,1%煌焦油藍(lán)染色后鏡下計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞(Ret)。

1.5.2 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)處死小鼠,取小鼠左側(cè)股骨,用2 ml沖洗液沖出骨髓,在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上測定骨髓有核細(xì)胞數(shù)(BMMNC)。

1.5.3 免疫學(xué)分型檢測 抗凝外周血和骨髓沖洗細(xì)胞用0.83%NHCl3裂解紅細(xì)胞后,分別加入相應(yīng)抗體進(jìn)行避光孵育,加入PBS終止反應(yīng)并用200目濾網(wǎng)過濾,送流式細(xì)胞儀(EPICS ALTRA,Beckman Coulter,美國)進(jìn)行檢測,用EXPO32軟件采集數(shù)據(jù)并用EXPO32 Analyze軟件分析數(shù)據(jù)。外周血檢測CD4、CD8、B220、CD40、CD80/86 等指標(biāo) ,骨髓有核細(xì)胞檢測 CD5、B220、Gr-1、Ter-119 、CD11b 等指標(biāo) 。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有資料處理用SPSS16.0版軟件包進(jìn)行分析,檢測結(jié)果以±s表示,經(jīng) Levene檢驗(yàn)后,采用LSD法檢驗(yàn)比較組間差異,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血常規(guī)指標(biāo)測定 外周血各項(xiàng)指標(biāo)中AA模型組小鼠與對照組相比見表1,WBC降低70.2%(P＜0.05),PLT降低39.4%(P＜0.05),RBC降低19.9%(P＜0.05),HGB降低17.0%(P＜0.05),Ret降低30.4%(P＜0.05);IR組與對照組相比,WBC降低52.1%(P＜0.05),其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 AA模型小鼠實(shí)驗(yàn)外周血常規(guī)及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)

表1 AA模型小鼠實(shí)驗(yàn)外周血常規(guī)及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)

*與Control組相比 P＜0.05,#與IR Control組相比P＜0.05

組別 WBC(109/L) RBC(1012/L) HGB(g/L) PLT(109/L) Ret(‰)Control 6.30±0.36 8.74±0.98 145.0±12.1 1016.4±88.1 86.2±10.7 IR Control 3.02±0.93* 8.04±0.90 132.2±12.3 816.2±128.1 69.8±8.2 AA模型 1.88±0.33*# 7.00±0.73* 120.4±15.1* 616.2±125.3* 60.0±18.9*

2.2 骨髓有核細(xì)胞免疫學(xué)分型 每只小鼠均取左側(cè)股骨沖洗骨髓后計(jì)數(shù)BMMNC,AA模型組較對照組低51.84%(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原進(jìn)行分型,見表 2,AA模型組Gr-1+、Ter-119+、CD11b+細(xì)胞比率均低于對照組(28.52%,P＜0.05;75.63%,P＜0.05;10.22%,P＞0.05);AA模型組CD5+、B220+細(xì)胞比率高于對照組(51.28%,P＜0.05;78.21%,P＜0.05)。IR組與對照組相比,只有BMMNC計(jì)數(shù)和B220+細(xì)胞2項(xiàng)指標(biāo)有顯著性差異。

表2 AA模型小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及免疫分型(±s)

表2 AA模型小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及免疫分型(±s)

*與Control組相比 P＜0.05,#與IR Control組相比P＜0.05

組別 BMMNC×106/股骨 CD5+(%) B220+(%) Gr-1+(%) Ter-119+(%) CD11b+(%)Control 22.56±3.19 1.90±0.59 6.10±6.86 80.28±8.57 5.18±1.75 66.72±11.17 IR 14.08±2.68* 3.76±0.84 21.28±11.80* 69.62±10.39 3.84±1.24 70.42±7.06 AA模型 10.00±2.17* 3.90±1.43* 28.52±9.17* 57.38±15.46* 1.26±0.30*# 59.90±9.52

2.3 外周血免疫學(xué)分型 外周血裂解紅細(xì)胞后對有核細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)分型,如表3所示。T淋巴細(xì)胞分型數(shù)據(jù)中,AA模型組CD4+細(xì)胞比例低于對照組42.49%(P＜0.05),CD8+細(xì)胞比例高于對照組100.59%(P＜0.05),CD4+/CD8+比例低于對照組(0.74±0.21%比2.32±0.88%,P＜0.05);T細(xì)胞活化相關(guān)的指標(biāo)中,AA模型組CD80/86+細(xì)胞和CD40+細(xì)胞均高于對照組(75.97%,P＜0.05;48.50%,P＜0.05);在對B220+檢測中各組間均未出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。IR組CD80/86+細(xì)胞比例高于對照組,與AA模型組趨勢相反,其余各指標(biāo)均與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

再生障礙性貧血是一組以造血組織功能衰竭為特征的綜合征,對外周血常規(guī)檢測和骨髓象分析是AA動物模型的基本評估方法[1,4,6]。在我們的研究中,建模第15天AA模型組小鼠外周血RBC、PLT、RBC、HGB和Rct顯著下降并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及分型結(jié)果如表2,AA模型小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量低于對照小鼠,Gr-1+細(xì)胞、Ter-119+細(xì)胞所占百分比和絕對數(shù)值均顯著低于對照組小鼠,CD11b+細(xì)胞百分比在各組間沒有顯著性差異,但AA模型組CD11b+細(xì)胞的絕對數(shù)值低于對照組57.77%,這表明AA模型組小鼠骨髓三系細(xì)胞均顯著低于對照組小鼠。AA模型組小鼠骨髓單核細(xì)胞中CD5+細(xì)胞和B220+細(xì)胞百分比高于對照組,提示骨髓中淋巴細(xì)胞比例增高,可能是骨髓中出現(xiàn)了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)所致,與相關(guān)研究報道相符[7]。我們構(gòu)建的AA小鼠模型,在外周血常規(guī)檢查、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)及分型等指標(biāo)均符合AA動物模型的要求,與臨床AA患者各項(xiàng)指標(biāo)相符或相近,說明我們構(gòu)建的AA動物模型是成功的。相比之下IR組僅有個別指標(biāo)與對照組具有顯著性差異,表明僅用4Gy劑量IR是不能單獨(dú)有效構(gòu)建AA動物模型的。對骨髓單核細(xì)胞利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各系血細(xì)胞比例,相比骨髓涂片鏡下檢測速度更快,結(jié)果更客觀和全面。

近年研究發(fā)現(xiàn),AA的發(fā)病機(jī)制除與造血干細(xì)胞本身缺陷、造血微環(huán)境損傷有關(guān)外,免疫異常是一個重要的因素,細(xì)胞免疫紊亂參與再障的發(fā)病。CD4+細(xì)胞是具有輔助誘導(dǎo)性T細(xì)胞亞群(Th),其增多表示B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白增多及細(xì)胞免疫增強(qiáng);CD8+是抑制性細(xì)胞(Ts)細(xì)胞毒性細(xì)胞(Tc)亞群,其增多表示免疫抑制;CD4+/CD8+比值表示Th與Ts之間功能平衡狀態(tài),是人體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要指標(biāo),比值降低可引起機(jī)體免疫功能紊亂。我們研究中外周血免疫學(xué)分型結(jié)果表明(表3),AA模型小鼠CD4+細(xì)胞比例低于對照組,而CD8+細(xì)胞比例高于對照組,CD4+/CD8+比例倒置,提示在我們構(gòu)建的AA動物模型中T細(xì)胞功能紊亂,細(xì)胞免疫參與了AA的發(fā)生,這與臨床AA患者情況基本相符[3]。

CD40分子屬于腫瘤壞死因子受體超家族,是I型膜蛋白,主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞,其配體CD40L(CD154)主要表達(dá)于活化T細(xì)胞。CD40與CD40L的相互作用,不僅通過B細(xì)胞調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答,而且可以增強(qiáng)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫功能,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。CD40異常表達(dá)是AA患者免疫功能紊亂的原因之一,并介導(dǎo)了對AA患者造血機(jī)能的破壞。我們的研究表明,AA模型小鼠外周血CD40+細(xì)胞比例顯著高于對照組,提示在我們構(gòu)建的AA動物模型中抗原遞呈加強(qiáng),體液免疫和細(xì)胞免疫都可能增強(qiáng)并參與AA的發(fā)生,這與臨床AA患者研究結(jié)果相符[8]。

T細(xì)胞免疫應(yīng)答是激發(fā)信號和抑制信號平衡的結(jié)果。CD28是T細(xì)胞最重要的共刺激分子,B7(CD80/86)分子表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞上,是CD28的配體分子。CD28/B7是主要的正向共刺激分子,通過促進(jìn)白細(xì)胞介素2(IL-2)分泌,延長淋巴細(xì)胞壽命,促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1分化,誘使 Thl/Th2失衡,增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量,維持T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[9]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明,B7高表達(dá),CD28/B7功能紊亂是AA發(fā)病中重要的環(huán)節(jié)[10]。在我們的研究中,AA模型小鼠外周血B7(CD80/86)分子表達(dá)水平顯著高于對照組,提示在我們構(gòu)建的AA動物模型中通過共刺激分子途徑增強(qiáng)了細(xì)胞免疫,可能參與了AA的發(fā)生,這與臨床AA患者研究結(jié)果相符[9,10]。

總之,我們成功構(gòu)建了AA的動物模型,在血常規(guī)、骨髓象等傳統(tǒng)評估項(xiàng)目上符合AA臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外我們還對外周血免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測,其中T細(xì)胞分類、功能等相關(guān)指標(biāo)與臨床AA患者的表現(xiàn)相符。今后,我們還需要對更多與AA致病相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評估,充分利用包括免疫學(xué)指標(biāo)的AA動物模型及檢測平臺,對AA的新療法進(jìn)行更全面的評估。

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