牛 輝,苑克偉,史美龍,陳治龍*

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院普外科,吉林吉林132011;2.吉林省人民醫(yī)院普外科)

血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(Angiotensin I-converting enzyme,ACE),又稱CD143,是腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,廣泛表達(dá)于多種器官和組織。參與腫瘤血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移[1]。ACE蛋白和mRNA在多種腫瘤中均有差異性表達(dá)[2]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)研究均顯示使用ACE抑制劑能夠減緩腫瘤生長(zhǎng)和血管生成[3]。由此認(rèn)為,ACE抑制劑有望成為新的抗腫瘤藥物,用于腫瘤的防治中。然而,ACE mRNA與結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系未見文獻(xiàn)報(bào)道,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá),初步探討其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及臨床應(yīng)用的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

結(jié)直腸癌癌組織及癌旁組織各31例,均來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本,手術(shù)切除組織立即液氮凍存,腫瘤組織均經(jīng)病理檢查證實(shí),為結(jié)直腸癌。其中男性15例,女性16例,平均年齡55.6(±13.4)歲。癌旁組織取自距結(jié)直腸癌病變邊緣2.0 cm的組織。

1.2 儀器與試劑

TRIpure Reagent購自北京百泰克公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreen II實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自Fermentas公司。參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)ACE引物[2]:上 游:5′-CTCAAGTACTTCCAGCCAGTC-3′;下游 :5′-GCAGAATCTTGCTGGTCT CTG-3′。內(nèi)參 GAPDH:上游引物 :5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′;下 游 引 物 :5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,引物由上海英俊生物有限公司合成。ABI7500熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄

取液氮凍存組織約60 mg,加入TRIpure 1 ml,勻漿,加入0.2 ml氯仿,離心后吸取上清,加入0.5 ml異丙醇,離心沉淀后棄上清,75%乙醇沉淀,無RNA酶水溶解RNA。取 1 μ l用NANODROP 1000超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量檢測(cè),分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒(Fermentas公司)操作說明書進(jìn)行,所得cDNA-20℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用EASY Dilution 將 cDNA 液按 100、101、102、103和104梯度稀釋后,各取 2 μ l進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)目的基因和內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增效率。20 μ l反應(yīng)體系中加入cDNA模版 2.0 μ l,SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μ l,上、下游引物(20 pmol/μ l)各 0.3 μ l,Rox Reference Dye II 0.4 μ l,去離子水補(bǔ)足 20 μ l。反應(yīng)條件:95℃10 s,95℃5 s,60℃34 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照,并分別加陰性對(duì)照。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性驗(yàn)證

熔解曲線驗(yàn)證引物的特異性(見圖1),結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物無非特異性條帶和引物二聚體形成,表明引物的特異性較好,可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

圖1 ACE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACE mRNA的表達(dá)

ACE mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(見表1)。結(jié)直腸癌組織ACE mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見表2。ACE mRNA在低分化結(jié)直腸癌患者組的表達(dá)明顯高于高中分化患者組(P＜0.05);在有轉(zhuǎn)移患者組的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移患者組(P＜0.05);在臨床Ⅰ-Ⅱ期和ⅢⅣ期患者組的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織ACE mRNA的表達(dá)情況

表2 ACE mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(Angiotensin I-converting enzyme,ACE),是一種含鋅屬二肽羧肽酶,主要作用是催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II,使緩激肽失活。近年來,研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中存在差異性表達(dá),參與腫瘤的多種病理生理過程,包括血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移等[1]。使用血管緊張素轉(zhuǎn)移酶能夠降低腫瘤的發(fā)生[3]。

Varela等測(cè)定了135例腫瘤患者和107例健康對(duì)照人群的血清ACE活性,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者,包括胃腸道腫瘤、乳腺癌、肺癌和頭頸癌血清ACE的活性明顯低于正常對(duì)照組,有轉(zhuǎn)移的肺癌患者中ACE活性明顯低于未轉(zhuǎn)移的肺癌患者,治療期間患者中ACE活性明顯低于恢復(fù)期患者,ACE活性越低,預(yù)后越差[4]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究證實(shí)了該結(jié)果[5,6]。由此認(rèn)為,血清ACE活性可以作為腫瘤標(biāo)記物,有望成為一種腫瘤臨床診斷和療效觀察的有效指標(biāo)。ACE基因位于人類第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂q23,其第16內(nèi)含子存在一段287堿基的插入缺失多態(tài)性,即(I/D多態(tài)性),該多態(tài)性與血漿ACE水平相關(guān),Ⅱ基因型顯著增加了中國(guó)人群結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7]。以上研究集中在ACE基因和酶活性方面,其轉(zhuǎn)錄水平的研究較少。

Rocken等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到ACE mRNA在結(jié)腸癌組織的表達(dá)比其在對(duì)應(yīng)的非病變組織的表達(dá)高約2.5倍[2]。然而,ACE mRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及其臨床病理特征的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)ACE mRNA在結(jié)直腸中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ACE mRNA在低分化結(jié)直腸癌患者組的表達(dá)明顯高于高中分化患者組;在有轉(zhuǎn)移患者組的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移患者組,表明ACE在結(jié)直腸癌的分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著較為重要的作用。雖然目前尚不清楚其準(zhǔn)確分子機(jī)制,但本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步深入研究ACE基因表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)病之間的機(jī)理奠定了有利的基礎(chǔ)。

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