石桂英，陳顯達(dá)，陳陟陽(yáng)，鞠振宇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

Exo-1基因?qū)Χ肆Ｃ溉毕菪∈笤煅杉?xì)胞植入效率的影響

石桂英，陳顯達(dá)，陳陟陽(yáng)，鞠振宇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

目的 利用不同的造血干細(xì)胞移植方式，探討Exo-1基因缺失對(duì)端粒酶基因敲除小鼠的造血干細(xì)胞植入效率的影響。方法 以CD45.1小鼠的骨髓細(xì)胞或骨髓造血干細(xì)胞為供體，以端粒酶基因敲除小鼠或Exo-1基因和端粒酶基因雙敲除小鼠為受體，在給予不同劑量X線照射或不照射的情況下，重復(fù)進(jìn)行靜脈注射全骨髓細(xì)胞或分選的骨髓造血干細(xì)胞(c-kit+、Sca-1+、lineage－，KSL)，于移植后1個(gè)月取外周血，流式分析嵌合率。結(jié)果未經(jīng)X線照射及1 Gy、2 Gy照射情況下，端粒酶基因缺陷受體小鼠的外周血中供體來(lái)源的細(xì)胞嵌合率較低;6 Gy照射后，供體來(lái)源的外周血細(xì)胞嵌合率仍低于50%，而且端粒酶基因缺陷受體小鼠在移植后1個(gè)月內(nèi)死亡較多;3 Gy照射可形成較高嵌合率，Exo-1基因缺失對(duì)端粒酶缺陷小鼠的造血干細(xì)胞植入效率的影響不顯著。結(jié)論 以端粒酶缺陷小鼠作為衰老模型研究造血干細(xì)胞植入效率時(shí)，3 Gy X線照射能夠有效地形成較高的外周血供體細(xì)胞的嵌合率，但是Exo-1基因沒(méi)有進(jìn)一步提高造血干細(xì)胞在端粒酶敲除小鼠的植入效率。

端粒酶基因缺陷;骨髓移植;造血干細(xì)胞;衰老

1 材料和方法

1.1 Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠

Exo-1基因敲除小鼠由德國(guó)引進(jìn)，Terc基因敲除小鼠及CD45.1小鼠由美國(guó)Jax lab引進(jìn)。Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠本實(shí)驗(yàn)室繁育［SCXK(京)2009-0007］。雙基因敲除小鼠的構(gòu)建見(jiàn)圖1。

圖1 Terc、Exo-1雙基因小鼠的構(gòu)建Fig.1 Construction of Terc，Exo-1 double gene knockout mice

1.2 基因敲除小鼠的基因型鑒定

用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。TERC敲除小鼠鑒定引物為：mTRR： 5′-TTCTGACCACCACCAACTTCAAT-3′，5PPgK：5′-G GGGCTGCTAAAGCGCAT-3′，mTRWtF：5′-CTAAGCCGGCACTCCTTACAA G-3′。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min;94℃ 變性 30 s，56℃ 退火 30 s，72℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。野生型片段為250 bp，TERC敲除片段為180 bp。Exo-1敲除小鼠鑒定引物為：Primer A：5′-CTTCGCTTTATGAAGCAGCC-3′，Primer B： 5′-AGGAGTAGAAGTGGCGCGAAGG-3′，Primer C： 5′-AGGAAAGAGTCAG AGTGCTGGC-3′。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 3 min;94℃ 變性 30 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。野生型片段為318 bp，Exo-1敲除片段為349 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL(試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司)。

1.3 制備單細(xì)胞懸液

移植用骨髓細(xì)胞取自2～3月齡CD45.1小鼠。小鼠脫頸椎處死后，無(wú)菌條件下，剝離后腿骨肌肉，用冰上預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲得全骨髓細(xì)胞。水平轉(zhuǎn)子離心，1000 r/min，10 min，棄上清，定容至 1 mL，50 μm 濾膜過(guò)濾，混勻后，取 10 μL 細(xì)胞，稀釋100倍，計(jì)數(shù)。分選用的細(xì)胞，離心后，加2 mL 0.83%NH4Cl裂解紅細(xì)胞2 min，加入5 mL染色緩沖液(含1%血清的PBS，SM)，水平轉(zhuǎn)子離心，1000 r/min，10 min，棄上清，加入 100 μL SM，混勻備用。

1.4 標(biāo)記抗體

分選用的骨髓細(xì)胞，加入 Biotin標(biāo)記的 Ter-119、Gr-1、Mac-1、B220、IL-7R、CD4、CD8 抗體混合液，冰上靜置 30 min，加 1 mL SM 洗，加 SA-PerCPCy5.5、Sca-1-PE、c-kit-APC，冰上靜置 30 min，1 mL SM洗，離心棄上清后，加300 μL SM懸浮細(xì)胞，50 μm濾膜過(guò)濾，備流式分選。

外周血細(xì)胞 80 μL，加 1 mL 0.83%NH4Cl，顛倒混勻后，室溫靜置 5 min，加 500 μL PBS中和，離心，2600 r/min，5 min，棄上清后，加 50μL SM，混勻。加 入 CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PECy7、CD11b-APC混合液，冰上靜置30 min，加1 mL SM，離心，2600 r/min，5 min，棄上清，加 300 μL PBS重懸細(xì)胞，50 μm濾膜過(guò)濾，備流式分析。

2 結(jié)果

2.1 雙基因敲除小鼠的構(gòu)建及分組

實(shí)驗(yàn)中采用Terc基因敲除第三代小鼠(G3)及Terc、Exo-1 雙基因敲除小鼠(G3Exo-1－/－)，將小鼠隨機(jī)分為8組，即A組：10只小鼠，未照射移植骨髓細(xì)胞，并于第一次移植2月后進(jìn)行連續(xù)三次移植;B組：4只小鼠，未照射移植骨髓造血干細(xì)胞(KSL);C組：10只小鼠，6 Gy照射后移植骨髓細(xì)胞;D組：8只小鼠，1 Gy照射后移植骨髓細(xì)胞;E組：10只小鼠，2 Gy照射后移植骨髓細(xì)胞;F組：4只小鼠，3 Gy照射后連續(xù)2次移植骨髓細(xì)胞;G組：4只小鼠，3 Gy照射后連續(xù)4次移植骨髓細(xì)胞;H組：4只小鼠，3 Gy照射后連續(xù)7次移植骨髓細(xì)胞。移植方式均采用眼后注射方法。不同組小鼠的基因型、移植細(xì)胞數(shù)等基本信息見(jiàn)表1。

表1 受體小鼠及移植方式Tab.1 The recipient mice and transplantation types

2.2 外周血分析結(jié)果

首先，我們對(duì)未經(jīng)放射線照射的受體小鼠進(jìn)行了全骨髓或造血干細(xì)胞(c-kit+、Sca-1+、lineage－，KSL)移植。移植后1個(gè)月采取外周血分析供體細(xì)胞所占比例，評(píng)價(jià)干細(xì)胞植入的效率。結(jié)果顯示，移植全骨髓細(xì)胞或KSL的嵌合率均較低(圖2A)。為提高干細(xì)胞植入效率，我們進(jìn)行了連續(xù)3次全骨髓移植。移植后嵌合率有所提高，但不能滿足實(shí)驗(yàn)要求(圖2B)。我們對(duì)連續(xù)移植的受體小鼠根據(jù)基因型分為2組，分析Exo-1基因敲除對(duì)植入效率的影響，結(jié)果顯示Exo-1基因敲除對(duì)植入效率影響不明顯(P=0.21，圖2C)。受體小鼠的嵌合率流式分析見(jiàn)圖2D。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，受體小鼠未接受照射的情況下，移植全骨髓細(xì)胞或 KSL的植入效率很低。為提高植入效率，我們對(duì)受體小鼠進(jìn)行低劑量(1 Gy、2 Gy)照射后，移植全骨髓細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入效率仍然很低;因此，我們對(duì)受體小鼠進(jìn)行6 Gy照射，此時(shí)嵌合率低于50%，而且在移植后1個(gè)月內(nèi)多數(shù)小鼠死亡;由于受體小鼠為短端粒小鼠，此種小鼠對(duì)放射線敏感［8］，所以我們降低放射線劑量，進(jìn)行3 Gy照射后移植全骨髓細(xì)胞，結(jié)果顯示植入效率較高，供體細(xì)胞的平均嵌合率達(dá)到70%以上(圖3A)。同時(shí)，我們進(jìn)行了連續(xù)移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)移植對(duì)植入效率影響不大(圖3B)。同時(shí)，分析結(jié)果顯示Exo-1基因缺失對(duì)供體細(xì)胞植入效率的影響不明顯(P=0.28，圖3C)。受體小鼠的嵌合率流式分析見(jiàn)圖3D。圖3見(jiàn)彩插2。

圖2 受體小鼠未經(jīng)照射移植全骨髓細(xì)胞或KSL細(xì)胞后的嵌合率以及流式分析圖Fig.2 Peripheral blood chimerism analysis of the non-irradiated recipients transplanted with bone marrow or KSL cells

3 討論

本研究中應(yīng)用衰老模型小鼠 Terc－/－(G3)和Terc－/－(G3)Exo-1－/－為受體，CD45.1 小鼠為供體，分離骨髓細(xì)胞后進(jìn)行不同處理，受體小鼠也進(jìn)行不同處理后，進(jìn)行骨髓移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體小鼠在不進(jìn)行放射線照射的情況下，無(wú)論是移植全骨髓細(xì)胞，還是分選的 KSL細(xì)胞，供體細(xì)胞的植入效率都很低，連續(xù)移植全骨髓細(xì)胞對(duì)植入效率影響不大，而且Exo-1基因敲除對(duì)植入效率無(wú)明顯影響 (圖2)。這與Deepta［9］等的研究結(jié)果有一定差別，可能與受體鼠的基因型不同有關(guān)。對(duì)受體小鼠進(jìn)行低劑量(1 Gy、2 Gy)照射后，植入效率較低，而對(duì)小鼠進(jìn)行6 Gy X線照射，則會(huì)導(dǎo)致多數(shù)受體小鼠在1個(gè)月內(nèi)死亡;在這種情況下，我們對(duì)受體小鼠進(jìn)行3 Gy照射后移植骨髓細(xì)胞，同時(shí)又分為連續(xù)移植2次、4次及7次組。結(jié)果顯示，3 Gy照射組的平均嵌合率大于70%。3 Gy照射后連續(xù)移植對(duì)植入效率無(wú)明顯影響，Exo-1基因敲除對(duì)植入效率也無(wú)明顯影響(圖3)。綜上可見(jiàn)，以衰老模型小鼠 Terc－/－(G3)和Terc－/－(G3)Exo-1－/－為受體進(jìn)行骨髓移植，要形成較高的嵌合率，必須進(jìn)行放射線照射，而該模型小鼠對(duì)放射線的耐受性較差，為保證小鼠的存活率，應(yīng)盡量降低放射線照射的劑量，3 Gy X線照射應(yīng)為比較合適的劑量。

(本文圖3見(jiàn)彩插2。)

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Influence of Exo-1 gene on the chimerism rate in telomerase-defecient mice

SHI Gui-ying，CHEN Xian-da，CHEN Zhi-ying，JU Zhen-yu
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To investigate the influence of Exo-1 gene deletion on the engraftment of hematopoietic stem cell(HSC)transplantation by different methods into the telomerase knockout mice.Methods Bone marrow cells or KSL((c-kit+，Sca-1+，lineage-)cells were isolated from CD45.1 mice，and then injected into recipients，which were telomerase gene knockout or Exo-1 and telomerase gene double knockout mice with or without irradiation.At 1 month later，peripheral blood was collected and analyzed by flow cytometry.Results Low chimerisms of donor-derived cells were observed in recipients without irradiation or with 1 Gy，2 Gy irradiation.With 6 Gy irradiation，the chimerisms were below 50%，and died in 1 month.With 3 Gy irradiation，most mice lived with high chimerisms.Conclusions 3 Gy X-ray irradiation gives rise to high chimerisms in telomerase knockout mice，whereas Exo-1 gene does not further increase the chimerisms of HSC transplantation.

Telomerase gene dysfunction;Bone marrow transplantation;Hematopoietic stem cells(HSCs);Aging;Mice

Q95-33，R457.7

A

1005-4847(2011)02-0095-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.002

衰老過(guò)程中，骨髓衰竭性疾病如再生障礙骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)等的發(fā)生率增加［1］。骨髓造血干細(xì)胞移植是目前唯一能夠徹底治愈該疾病的治療方法［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大于40歲的患有骨髓衰竭性疾病的患者，骨髓造血干細(xì)胞的植入效率降低，治療效果較差［3］。如何提高骨髓造血干細(xì)胞的植入效率是臨床上關(guān)注的重要課題。研究表明，端粒酶基因突變和端?？s短是人類衰老和骨髓衰竭性疾病發(fā)生的重要原因之一［4-6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，端?？s短引起的骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境的衰老是影響骨髓造血干細(xì)胞植入效率的重要原因之一［7］。前期研究還發(fā)現(xiàn)Exo-1缺失延長(zhǎng)了端粒酶基因缺陷小鼠的壽命，并可能改善了端粒縮短引起的骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境的衰老。為進(jìn)一步研究Exo-1基因?qū)Χ肆Ｃ溉毕菪∈笤煅杉?xì)胞植入效率的影響，本研究選用第3代端粒酶基因缺陷小鼠(G3Terc－/－)作為衰老模型小鼠，分別探討了在不同劑量放射線照射、不同移植次數(shù)以及不同純度的供體干細(xì)胞等情況下Exo-1基因缺失對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的植入效率的影響。

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目［30771189］;北京市科委科技新星計(jì)劃［2008A115］。

石桂英(1977－)，女，主管技師，研究方向：衰老與再生。

鞠振宇，男，研究員，研究方向：衰老與再生。E-mail：zhenyuju@hotmail.com

2010-09-30