謝三平,陳吉相,李慧,徐婧,黃園園

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430022;2.荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北荊州 434020

攜帶人類GAD67基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞*

謝三平1,2,陳吉相1#,李慧1,徐婧1,黃園園1

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430022;2.荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北荊州 434020

目的:構(gòu)建攜帶人類谷氨酸脫羧酶67(GAD67)基因的真核表達(dá)載體pDC316-CMVEGFP-GAD67,并轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)。方法:利用基因重組技術(shù),構(gòu)建 pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達(dá)載體;利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染通過貼壁方法分離培養(yǎng)出來的BMSCs,熒光顯微鏡下觀察并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率,免疫組化檢測GAD67蛋白在BMSCs中的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染BMSCs后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后48 h的轉(zhuǎn)染效率為37.3%,免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后48 h,BMSCs內(nèi)GAD67蛋白呈陽性表達(dá)。結(jié)論:構(gòu)建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染BMSCs。

谷氨酸脫羧酶67;真核表達(dá)載體;轉(zhuǎn)染;骨髓基質(zhì)細(xì)胞

#【通訊作者】陳吉相,Tel:86-27-85726203,E-mail:cz283895@yahoo.cn

研究顯示,癲癇的發(fā)生與神經(jīng)元退行性變性引起的腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)與抑制性遞質(zhì)系統(tǒng)功能失衡有密切聯(lián)系。谷氨酸(glutam inic acid,GLU)和γ-氨基丁酸(gamma-am inobutyric acid,GABA)是調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性與抑制性平衡最重要的2種遞質(zhì),谷氨酸脫羧酶(g lu tamic acid decarboxylase,GAD)催化GLU脫羧反應(yīng)生成GABA。GAD有GAD65和GAD67兩種亞型,其中GAD67在調(diào)節(jié)GABA的生成和釋放中起主要作用[1]。利用攜帶及表達(dá)GAD67基因的神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植治療癲癇可能具有重要價(jià)值[2]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrow stromal cells,BMSCs)是骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞以外的非造血干細(xì)胞,屬于多能干細(xì)胞[3],在特定條件下,可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[4-8],還能分化為神經(jīng)前體細(xì)胞[9,13],具有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能,被作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中。本研究利用基因重組技術(shù),通過酶切、連接重組方法構(gòu)建攜帶人類GAD67基因片段的真核表達(dá)載體 pDC316-CMV-EGFPGAD67后,借助轉(zhuǎn)基因技術(shù),利用脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染入BMSCs,觀察其轉(zhuǎn)染效果及轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究基因修飾后的BMSCs移植治療癲癇提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:雌性SD大鼠,體質(zhì)量為(150±15)g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。②主要試劑與材料:NotI、SpeI及 T4連接酶(購于 NEB公司);Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司);小牛腸堿性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)(購于 Prom ega公司);PCR引物、LipofectamineTM2000(購于 Invitrogen公司);DNA凝膠回收與純化試劑盒(購于北京博邁德科技發(fā)展有限公司);無內(nèi)毒素高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司);DNA Marker(購于諾維森生物科技有限公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(購于Hyclone公司);胎牛血清(購于杭州四季青生物工程有限公司);胰蛋白酶(購于Ameresco公司);G418(購于Calbiochem公司);兔抗人GAD67多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB底物顯色試劑盒(購于武漢博士德生物工程有限公司)。③質(zhì)粒和菌株:感受態(tài)DH 5α(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司);真核表達(dá)載體 pDC316-cm v-EGFP和 pCM V6-XL5-GAD67質(zhì)粒[毅新興業(yè)(北京)科技有限公司提供]。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pDC316-CMV-EGFPGAD67的構(gòu)建及鑒定 由毅新興業(yè)(北京)科技有限公司完成。

1.2.2 BMSCs的分離、培養(yǎng) 取SD大鼠1只,10%水合氯醛0.3m L/100g體質(zhì)量腹腔注射麻醉,75%的乙醇浸泡5min,無菌條件下分離雙側(cè)股骨、脛骨,沿骨骺線剪去兩端,無菌注射器抽取6 m L培養(yǎng)液(含20%胎牛血清的DM EM/F12)沖出骨髓液,反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液,200 mm濾網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞懸液,4℃離心6min,去掉上清,加入新培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液后接種于50 m L培養(yǎng)瓶中,放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液,去掉未貼壁細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng);4 d后再次換液。第9天時(shí)細(xì)胞生長融合達(dá)90%左右,用0.25%的胰蛋白酶室溫下消化約60 s,鏡下觀察貼壁細(xì)胞突起收縮,細(xì)胞變圓開始漂浮時(shí)倒掉消化液,加入含血清的培養(yǎng)液終止消化,吸管吹打并混勻成單細(xì)胞懸液,分裝入2個(gè)50 m L培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),以后傳代1次/周,中途換液1次。

1.2.3 pDC316-CMV-EGFP-GAD67載體轉(zhuǎn)染BMSCs 取第3代BMSCs,按1×106個(gè)/孔接種于24孔板中,第2天鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)85%左右即進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染參照LipfectamineTM2000說明書進(jìn)行,每孔加質(zhì)粒DNA 1 μg,Lip fectamineTM2000 2 μL,無血清培養(yǎng)基室溫下孵育后轉(zhuǎn)染,6 h后更換含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)空白對照組(僅加等量質(zhì)粒DNA),空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(僅加等量 LipfectamineTM2000)、完全空白組。并于轉(zhuǎn)染24 h后加入G418(400μg/m L)加壓篩選。

1.2.4 pDC316-CMV-EGFP-GAD67載體轉(zhuǎn)染BMSCs檢測 分別于轉(zhuǎn)染后24、48及72 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在BMSCs中的表達(dá);轉(zhuǎn)染后48 h,選取5張片子,每張片子隨機(jī)取10個(gè)高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,陽性細(xì)胞百分比=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù) +陰性細(xì)胞數(shù))×100%;并于48 h后消化轉(zhuǎn)染的BMSCs,滴管吹打成單細(xì)胞懸液,取1.5 m L的細(xì)胞懸液流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后GAD67蛋白在BMSCs中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后消化BMSCs,吹打成單細(xì)胞懸液,接種于蓋玻片上培養(yǎng),次日細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基,PBS溶液沖洗2遍,4%多聚甲醛固定20min后棄掉固定液,PBS溶液洗2遍;加入一抗(兔抗人GAD67多克隆抗體,1∶100稀釋),4℃濕盒過夜,再37℃孵育1 h,PBS沖洗,5min/次,共3次;加二抗(生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,1∶100稀釋),37℃濕盒孵育1 h,PBS沖洗,5min/次,共3次;按SP免疫組化試劑盒說明進(jìn)行,DAB顯色。同時(shí)設(shè)空白對照和未加一抗的陰性對照。普通光鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 pDC316-CM V-EGFP-GAD67的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建 pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達(dá)載體后通過PCR引物鑒定正反,并電泳檢測,見圖1A;挑選出陽性克隆行雙酶切驗(yàn)證,可切出雙條帶,見圖1B;對經(jīng)過酶切結(jié)果呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序,分別對其5'-端進(jìn)行正向測序和3'-端進(jìn)行反向測序,將測序結(jié)果與NCBI上的NM_000817分別進(jìn)行比對,結(jié)果顯示插入pDC316-CM V-EGFP-GAD67真核表達(dá)載體中的GAD1cDNA序列正確,全長3.5 kbp。

2.2 BMSCs的體外培養(yǎng)及觀察 倒置顯微鏡下觀察,初種細(xì)胞呈圓形,散在懸浮于培養(yǎng)液中;72 h后首次換液時(shí),顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞貼壁生長,呈圓形、梭形或不規(guī)則形,見圖2A;傳代后的細(xì)胞生長形態(tài)較均一,折光性強(qiáng),呈紡錘狀,長突起延伸于兩端,漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀排列,見圖2B。

2.3 轉(zhuǎn)染結(jié)果及轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察,PDC316-CMV-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孔及 pDC316-CMV-EGFP-GAD67轉(zhuǎn)染孔均可見綠色熒光,見圖2C、2D;72 h時(shí)發(fā)綠色熒光細(xì)胞增加,熒光亮度增強(qiáng),見圖2E;空白對照孔中無綠色熒光,見圖2F;轉(zhuǎn)染后48 h,GAD67陽性細(xì)胞百分比為(15.6±4.15)%;48 h后流式細(xì)胞儀檢測pDC316-CM V-EGFP-GAD67轉(zhuǎn)染BMSCs效率為37.3%,見圖2G。

2.4 轉(zhuǎn)染后BMSCs中GAD67蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測顯示,轉(zhuǎn)染48 h后的BMSCs內(nèi)GAD67蛋白呈陽性表達(dá),見圖2H,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白對照組均未見陽性表達(dá),見圖 2I、2J。

3 討論

目前認(rèn)為癲癇發(fā)病的最終環(huán)節(jié)與腦內(nèi)興奮性及抑制性遞質(zhì)功能失衡有關(guān)。GAD是調(diào)節(jié)GLU與GABA生成平衡的關(guān)鍵酶,GAD功能下調(diào)將會導(dǎo)致GABA遞質(zhì)功能相對或絕對不足,造成興奮性與抑制性神經(jīng)功能的失調(diào)[10,11]。GAD功能下調(diào)可能與GABA能為主的抑制性中間神經(jīng)元(GAD陽性神經(jīng)元)的減少有關(guān)[12]。增強(qiáng)癲癇患者致癇灶中的GABA能細(xì)胞的作用或移植GABA能神經(jīng)元到癲癇患者致癇灶中以補(bǔ)充其不足,可能對癲癇、尤其對難治性癲癇起到意想不到的治療效果。

圖1 A-B A:菌落PCR結(jié)果,1、3孔道內(nèi)的克隆為陽性克隆,5孔道為DNA Marker(上至下依次為2000,1000,750,500,250,100 bp);B:酶切鑒定結(jié)果,1孔道為酶切產(chǎn)物,其中A為pDC316-CMV-EGFP質(zhì)粒,B為GAD67片段,2孔道為酶切前的質(zhì)粒,3孔道為DNA Marker

圖2 A-J 原代培養(yǎng)72 h(A)及傳代后(B)的 BMSCs形態(tài)(倒置顯微鏡,×200);空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(C)、轉(zhuǎn)染后24 h(D)、72 h(E)、未轉(zhuǎn)染(F)BMSCs熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(熒光顯微鏡,×200)及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(G);轉(zhuǎn)染48 h后(H)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(I)及空白對照組(J)的BMSCs內(nèi)GAD67蛋白免疫組化染色結(jié)果(光學(xué)顯微鏡,×100)

BMSCs是廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究中非胚源性多能干細(xì)胞,Wislet-Gendebien等[9]將BMSCs與小腦顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)成體BMSCs能表達(dá)神經(jīng)元特異抗原,并具備神經(jīng)細(xì)胞樣功能,可與GABA、甘氨酸、GLU等神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生單程動作電位。Tseng等[13]研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在體外經(jīng)生長因子和化學(xué)處理后,可向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)記如神經(jīng)絲蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、Tau蛋白,少量神經(jīng)樣細(xì)胞可分泌GABA。諸多體外研究都發(fā)現(xiàn)BMSCs可能具有功能性神經(jīng)細(xì)胞分化潛能[9,13],且可來源于自體、取材方便、并可避免免疫排斥反應(yīng)等,是理想的種子細(xì)胞[14]。體內(nèi)研究也證實(shí) BMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用價(jià)值。Shen等[15]將BMSCs移植治療大腦中動脈閉塞腦動物模型,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植治療2周后腦缺血動物的神經(jīng)缺失癥狀開始得到改善,且療效至少可持續(xù)1年;原位雜交反應(yīng)顯示,移植后的細(xì)胞可在宿主腦內(nèi)存活并部分[(22.3±1.95)%]表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic p rotein,GFAP),部分[(16.8±2.13)%]表達(dá)神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白-2(microtubu le associated p rotein-2,MAP-2),增加缺血組織周圍突觸囊泡蛋白表達(dá),明顯減輕突觸缺失。BMSCs作為基因治療的載體細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究也曾有報(bào)道,Lu等[16]利用腺相關(guān)病毒載體將多巴胺生成限速酶-酪氨酸羥化酶(ty rosine hydroxylase,TH)基因?qū)隑MSCs,然后將表達(dá) TH基因的 BMSCs移植到帕金森病模型鼠的紋狀體內(nèi)后觀察發(fā)現(xiàn),治療組阿撲嗎啡誘導(dǎo)的不對稱旋轉(zhuǎn)癥狀較對照組明顯減輕,6周后免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)TH基因主要在移植點(diǎn)周圍表達(dá),高效液相色譜儀及電化學(xué)檢測證實(shí)TH基因修飾的BMSCs紋狀體內(nèi)移植可明顯增加移植點(diǎn)周圍多巴胺遞質(zhì)水平。

目前有關(guān)GAD67基因修飾的BMSCs致癇灶內(nèi)定向移植治療癲癇的研究還未曾見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的帶有綠色熒光標(biāo)記的GAD67基因真核表達(dá)載體pDC316-CM V-EGFP-GAD67可通過脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)入BMSCs中,并在轉(zhuǎn)染后的BMSCs中呈陽性表達(dá),提示外源GAD67基因可在 BMSCs中有效表達(dá),為下一步GAD67基因修飾的BMSCs致癇灶內(nèi)定向移植治療癲癇的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但在本研究中還發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)染效率不高(37.3%),轉(zhuǎn)染后GAD67基因在BMSCs中的表達(dá)不夠理想,GAD67陽性細(xì)胞僅為(15.6±4.15)%,長時(shí)間加壓篩選培養(yǎng)后外源基因在BMSCs中的表達(dá)有衰減趨勢,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力下降等一系列問題,而且轉(zhuǎn)染后GAD67基因能否在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)功能性GAD67蛋白,有效增加細(xì)胞內(nèi)外抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA濃度,還有待后期進(jìn)一步探究。

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To Construct Eukaryotic Expression Vector with GAD67 Gene and Transfect It into Bone Marrow

Strom al Cells

XIE San-ping▲,CHEN Ji-xiang,L I H ui,XU Jing,HUANG Yuan-yuan.▲Departmentof Neurology,Union Hospital,Tongji Med ical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Ob jective:To constructhuman g lutamic acid decarboxy lase(GAD67)gene's recombinant eukaryotic expression vector pDC316-CMV-EGFP-GAD67 and to transfect it into bone marrow strom al cells(BMSCs)of rats.Methods:Eukaryotic exp ression vector pDC316-CMVEGFP-GAD67 was constructed with the technique of gene rearrangement.BMSCs of rats were cultivated by their adherence-dependent growth character,and the recombinant pDC316-CMVEGFP-GAD67 was transferred into the BSMCswith lipofectam ineTM2000.The cellswere observed by fluorescencemicroscopy,the efficiency of transfection was assessed by flow cytometry,and the expression of GAD67 protein in BMSCs w as detected by immunohistochemistry after transfecting.Results:The pDC316-CMV-EGFP-GAD67was constructed successfu lly.Green fluorocy tes were detected under fluorescence microscopy after transfection and the efficiency of transfection w as 37.3%at 48 hours post transfection.GAD67p rotein exp ressed in tansfected BM SCs at 48 hours post transfection.Conclusion:The eukaryotic expression vector pDC316-CMV-EGFPGAD67 was successfully constructed and effectively transfected into BMSCs.

g lutamic acid decarboxy lase67;eukaryotic exp ression vector;transfection;boneMarrow stromal cells

Q782;R742.2

A

1001-117X(2011)04-0235-06

10.3870/sjsscj.2011.04.001

湖北省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.GGS0064)

2011-06-09