白 楊, 錢 斯 日 古 楞, 王 紅 英, 馬 蕾

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

膠原蛋白獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)使其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定[1],一般的加工溫度及短時(shí)間加熱都不能使其分解,從而造成其消化吸收困難。將膠原蛋白水解為膠原多肽則其在消化吸收、營養(yǎng)、功能特性等方面都會(huì)得到顯著的提高。利用生物酶降解膠原蛋白是制備小分子膠原蛋白的最佳途徑。微生物膠原酶來源廣泛,近年來的研究表明,許多土壤、皮毛、海水來源的微生物都能產(chǎn)生膠原酶[2]。目前,應(yīng)用最廣的細(xì)菌膠原酶是Clostridiumhistolyticum膠原酶,但其分離純化較為困難并且經(jīng)常伴有毒素的產(chǎn)生,更具優(yōu)勢的細(xì)菌源膠原酶有待開發(fā)。本文所涉及的Aeromonassp. F3是一種海洋微生物,是通過明膠培養(yǎng)基篩選所得到的膠原酶高產(chǎn)菌株,所分泌的胞外酶對(duì)膠原蛋白有良好的降解作用。Aeromonassp. F3屬于弧菌科的氣單胞菌屬,是一類接近球狀的革蘭氏陰性菌,能產(chǎn)生明膠酶[3],本研究是以該菌株出發(fā),發(fā)酵獲取膠原酶,對(duì)該膠原酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì),包括酶解條件及其熱穩(wěn)定性進(jìn)行了初步的探討,并對(duì)該酶水解魚皮膠原蛋白的產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要材料

產(chǎn)膠原酶菌株Aeromonassp. F3,本實(shí)驗(yàn)室從海灘污泥中篩選。魚皮,大連海洋大學(xué)提供。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖3 g/L,酵母浸粉9 g/L,氯化鈉5 g/L,硫酸錳10 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 膠原酶生產(chǎn)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

于保存斜面上挑取一菌環(huán)接入種子培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基即LB培養(yǎng)基,于40 ℃、180 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h,4 ℃冰箱保存。將種子培養(yǎng)基接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,在最佳產(chǎn)酶條件下(溫度40 ℃,初始pH 8.0)振蕩培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 膠原酶的提取

取發(fā)酵液,在8 000 r/min冷凍離心5 min,去沉淀取上清液。冰浴條件下,邊攪拌邊緩慢加入乙醇,使乙醇最終達(dá)到70%[4],4 ℃靜置過夜,8 000 r/min冷凍離心15 min,棄上清液,按照所需的pH以相應(yīng)的Tris-HCl緩沖液將沉淀復(fù)溶,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 膠原酶活力測定

取酶液1 mL加入試管中,將試管置于40 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min,加入同樣預(yù)熱5 min的2%酪蛋白溶液l mL,精確計(jì)時(shí)10 min后加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)[5]。對(duì)照組試管的三氯乙酸在加入酪蛋白溶液之前加入試管。取反應(yīng)液過濾,用福林法[6]測定酪氨酸濃度,計(jì)算相對(duì)百分比。

1.2.4 水解效果的研究

取酶液與少量魚皮混合,在最適溫度及pH條件下振蕩24 h。酶解反應(yīng)后將混合液離心去除沉淀,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,確定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)酶活的影響

取pH分別為7.7、8.0、8.3、8.6和8.9的酶液,測定相對(duì)酶活,確定最佳酶解pH。結(jié)果如圖1所示,pH 7.7開始,酶活一直上升,pH 8.6時(shí)酶活達(dá)到峰值,因此最佳pH控制在8.6。

圖1 pH對(duì)酶活的影響

2.2 膠原酶的熱穩(wěn)定性

取5份酶液,分別以20、30、40、50、60 ℃恒溫水浴鍋水浴保溫40 min,測定殘留酶活,確定酶液的熱穩(wěn)定性,結(jié)果見圖2。由圖2可見,20、30、40 ℃處理過的酶液,其剩余酶活差別不大,而50 ℃以上溫度處理40 min后的酶液基本失活。

圖2 膠原酶的熱穩(wěn)定性

2.3 溫度對(duì)酶活的影響

取5份酶液,分別以20、30、40、50、60 ℃的酶解反應(yīng)溫度測定酶活,確定酶液的最佳催化溫度,結(jié)果見圖3。由圖3可見,在50 ℃時(shí)膠原酶的催化能力最強(qiáng),考慮到50 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性,在長期的酶解過程中,40 ℃才是催化溫度的合理選擇。

圖3 溫度對(duì)酶活的影響

2.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

分別將酶液加入不同濃度的氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅及硫酸錳中,測定相對(duì)酶活,確定最佳金屬離子及其濃度,結(jié)果如圖4。由圖4可見,其中鎂離子以及高濃度的鈣離子對(duì)膠原酶有輕微的抑制作用；銅離子、亞鐵離子、鋅離子和錳離子對(duì)膠原酶均有不同程度的抑制作用,只有在酶解過程中加入0.5 mmol/L的鈣離子,能將酶活提高5%左右。

2.5 Aeromonas sp. F3 膠原酶對(duì)魚皮的水解效果分析

圖4 金屬離子對(duì)酶活的影響

取pH為8.6的酶液,并加入濃度為0.5 mmol/L的氯化鈣,與適當(dāng)魚皮混合,同時(shí)取無菌水與等量魚皮混合作為對(duì)照,將兩種混合液在40 ℃、180 r/min條件下反應(yīng)24 h,以魚皮與無菌水的混合液作對(duì)照。圖5為水解后的效果圖,由圖5可以看出,水解液顏色由澄清變?yōu)闇啙?魚皮也由水解前的片狀變?yōu)闈{狀,可見該膠原酶對(duì)魚皮確實(shí)具有水解能力。將水解液離心取上清液上樣電泳,標(biāo)準(zhǔn)Maker成分為:肌球蛋白200.0 ku；β半乳糖苷酶116.0 ku；磷酸酶b 97.2 ku；牛血清蛋白66.4 ku；卵清蛋白44.3 ku；碳酸苷酶29.0 ku；胰蛋白酶抑制劑20.1 ku,電泳結(jié)果見圖6。魚皮經(jīng)膠原酶水解后的分子質(zhì)量低于30 ku。

圖5 水解效果圖

圖6 SDS-PAGE電泳圖

3 結(jié) 論

該菌所產(chǎn)胞外蛋白酶的最佳酶解pH為8.6,在pH 9.0附近,膠原酶仍具有很大活性,體現(xiàn)了海洋酶耐堿的特點(diǎn)。50 ℃以上時(shí),該膠原酶的穩(wěn)定性不佳,40 min之內(nèi)基本完全失活。短時(shí)間內(nèi)的酶解反應(yīng)過程中,50 ℃的條件能使酶活達(dá)到最高,但是具體實(shí)驗(yàn)過程中,時(shí)間都超過1 h甚至更長,參照該酶的熱穩(wěn)定性,40 ℃才是酶解反應(yīng)的最佳選擇。

有研究指出,鈣離子對(duì)一千多種蛋白酶都有促進(jìn)作用,且其促進(jìn)作用與濃度有很大關(guān)系[7]。本實(shí)驗(yàn)也可以看出,在提及的6種金屬離子,在濃度不同時(shí),每種金屬離子對(duì)酶活的影響都不盡相同。其中只有鈣離子在低濃度時(shí)對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用,但是其影響不大。

參照最佳酶解條件,用粗提的膠原酶對(duì)魚皮進(jìn)行水解反應(yīng),效果是比較好的,水解液從之前的較為澄清變得渾濁,可見粗提的酶液對(duì)魚皮確實(shí)有水解作用。從水解產(chǎn)物分子質(zhì)量的角度來看,產(chǎn)物的分子質(zhì)量只達(dá)到了30 ku左右,相對(duì)較大?？紤]用兩步酶法[8]進(jìn)行降解,會(huì)達(dá)到更好的效果。

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