陳 霞, 莫 新 迎, 韓 丹, 姜 曉 雷, 李 明 達(dá), 趙 長(zhǎng) 新

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的重要原料,而蛋白質(zhì)含量是大麥質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。大麥蛋白質(zhì)含量的高低及類型,直接影響制麥和釀造工藝及啤酒的質(zhì)量。大麥中在經(jīng)歷發(fā)芽、糖化以及煮沸發(fā)酵等一系列釀造過程后活性仍然能夠得以保存[1-2]的蛋白質(zhì)成為熱穩(wěn)定蛋白質(zhì),其中能夠促進(jìn)啤酒泡沫生成并增強(qiáng)啤酒泡沫穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)稱為泡沫蛋白質(zhì),這兩種蛋白質(zhì)成為決定啤酒口感風(fēng)味、泡沫及膠體穩(wěn)定性等品質(zhì)指標(biāo)[3]。大麥熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)分為熱穩(wěn)定性水溶蛋白質(zhì)(清蛋白質(zhì))、熱穩(wěn)定性鹽溶蛋白質(zhì)(球蛋白質(zhì))、熱穩(wěn)定性醇溶蛋白質(zhì)(醇溶蛋白質(zhì))和熱穩(wěn)定性堿溶蛋白質(zhì)(谷蛋白質(zhì))。其中大麥中重要的泡沫蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)Z和LTP蛋白,蛋白質(zhì)Z占水溶蛋白質(zhì)總量的5%左右,能夠增強(qiáng)泡沫的穩(wěn)定性與啤酒的非生物穩(wěn)定性[4],LTP是小分子球蛋白質(zhì),分子質(zhì)量約10 ku。熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)在釀造過程中分子的大小和構(gòu)象上發(fā)生了改變,促使其泡沫活性也發(fā)生了變化[5],因此對(duì)大麥及啤酒中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的研究越來越多并受到廣泛的關(guān)注[6]。

用于釀造的大麥的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為9.0%～12.0%。作者以不同蛋白質(zhì)含量的釀造大麥(甘啤三號(hào),其總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為9.4%、10.8%和11.5%)為研究對(duì)象,利用Bradford法和SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)其熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)組成及含量與發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)含量及組成變化進(jìn)行分析,以期為評(píng)估大麥以及預(yù)測(cè)麥芽質(zhì)量和啤酒泡沫的品質(zhì)提供借鑒與參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甘啤三號(hào)(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.4%),甘啤三號(hào)(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.8%),甘啤三號(hào)(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.5%),由大連中糧麥芽有限公司提供。

試劑:SDS-PAGE低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),上海凱博生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250/R250;甘氨酸,Amresco;牛血清白蛋白質(zhì); DTT,Merk;丙烯酰胺;EDTA·Na2,Sigma;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZPS-250 H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱,黑龍江東拓儀器制造有限公司;pH計(jì),Mettler-Toledo Delta320;Unic-7200分光光度計(jì),上海尤尼柯儀器有限公司;JM-250型小型電泳儀,大連捷邁科貿(mào)有限公司;低速離心機(jī)LD4-2 A,北京醫(yī)用離心機(jī)廠;YM50全自動(dòng)不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器,上海三申醫(yī)療器材有限公司;蛋白質(zhì)測(cè)定儀 KDN-05A,上海貝特儀電設(shè)備廠。

1.3 方 法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取

1.3.1.1 熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的提取

(1)準(zhǔn)確稱取粉碎后的大麥1 g(扣除水分后的絕干質(zhì)量),加入去離子水5 mL,搖勻;(2)60 ℃水浴中提取2 h,每10 min搖1次;(3)2 800g離心15 min,保留上清液作為水溶蛋白質(zhì);(4)在沉淀中再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl溶液5 mL,過程同步驟(2),上清液為鹽溶蛋白質(zhì);(5)在沉淀中再添加體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇(含少量巰基乙醇)溶液5 mL,過程同步驟(2),獲得醇溶蛋白質(zhì);(6)剩余的沉淀中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% NaOH溶液5 mL,過程同步驟(2),獲得堿溶蛋白質(zhì);(7)將上述4種蛋白質(zhì)粗提液于沸水中水浴20 min,2 800g離心15 min,所得上清液為大麥熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)提取液[7]。

1.3.1.2 泡沫蛋白質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取大麥1 g (粉碎后扣除水分后的絕干質(zhì)量),加入4 ℃提取液(NaCl 10 mmol/L,Tris-Cl 50 mmol/L,EDTA·Na21 mmol/L,DTT 1 mmol/L,pH 7.5) 5 mL,搖勻,置4 ℃浸提取2 h,每隔10 min搖一次。2 800g離心15 min,得上清液為泡沫蛋白質(zhì)粗提液。將此泡沫蛋白的粗提液于沸水中水浴20 min,2 800g離心10 min,所得上清液為泡沫蛋白質(zhì)提取液[7]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用Bradford法,牛血清白蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。分別配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的牛血清蛋白質(zhì)溶液,做兩組平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下:從配置好的不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白質(zhì)溶液中分別取0.1 mL,分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)工作液,搖勻后靜置5 min,于A595nm處測(cè)吸光值。計(jì)算平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值作圖[7]。

1.3.3 SDS-PAGE

在Laemmli不連續(xù)系統(tǒng)、4 ℃環(huán)境下進(jìn)行電泳,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% (80 mm×80 mm×1 mm),濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%(80 mm×8 mm×1 mm)?？捡R斯亮藍(lán)R250對(duì)凝膠進(jìn)行染色,用脫色搖床對(duì)凝膠脫色至背景透明后拍照[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變化

2.1.1 熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量變化

從圖1看出,大麥中的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)與大麥含有的總蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的11.5%甘啤三號(hào)所含的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)始終最高。大麥間蛋白質(zhì)的差異有可能來自蛋白質(zhì)對(duì)溶解液的溶解性以及高溫對(duì)蛋白質(zhì)作用的影響。圖1中大麥中熱穩(wěn)定性醇溶蛋白質(zhì)含量相對(duì)其他熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)最高,其次是熱穩(wěn)定性鹽溶蛋白質(zhì),大麥熱穩(wěn)定性堿溶蛋白質(zhì)含量最低。

圖1 不同蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大麥中熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

大麥蛋白質(zhì)含量的高低及類型,直接影響制麥和釀造工藝及啤酒的質(zhì)量,品種相同的大麥在蛋白質(zhì)含量上也是存在差別的,大麥中不同蛋白質(zhì)的分布因大麥總氮的變化而變。實(shí)驗(yàn)證明,大麥中的蛋白質(zhì)經(jīng)過高溫煮沸其結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的變化,使得結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。例如斯克里邦(Scriban 1953)證明,水溶蛋白質(zhì)可以分為B1和B2組,B1組于煮沸時(shí)凝固沉淀,它可能是與多糖結(jié)合的物質(zhì),對(duì)啤酒泡沫起重要作用,它存在于β-淀粉酶中。作為貯存蛋白質(zhì)尤其是大麥醇溶蛋白質(zhì)隨總氮的增加而明顯增加,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以在36%～49%變化,并與大麥品種的特性相關(guān),高賴氨酸大麥突變品種的醇溶蛋白質(zhì)隨總氮的增加與其他蛋白質(zhì)的變化同比例,而其他蛋白質(zhì)只有少量的增加。從圖1中可以看出大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量變化也遵循這一規(guī)律,與大麥中蛋白質(zhì)含量變化情況基本相同。

2.1.2 大麥熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜分析

從圖2、3不同蛋白質(zhì)含量大麥熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)電泳圖譜可以看出,3個(gè)大麥總蛋白質(zhì)雖然不同但熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)組成基本相同。熱穩(wěn)定性水溶蛋白質(zhì)主要由分子質(zhì)量約40 與5～15 ku兩部分組成,熱穩(wěn)定性鹽溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在72、57、40與5～23 ku四部分,熱穩(wěn)定性醇溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在94、60、29～54與5～15 ku 四部分,熱穩(wěn)定性堿溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在94、60、50、40與5～23 ku五部分。

2.2 大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)的變化

2.2.1 大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)含量的變化

由Bradford法測(cè)定高蛋白質(zhì)含量與低蛋白質(zhì)含量的兩種大麥發(fā)芽各階段泡沫蛋白質(zhì)含量結(jié)果(圖4)可見:高蛋白質(zhì)含量大麥中泡沫蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(3.25 mg/g)高于低蛋白質(zhì)含量的大麥(2.95 mg/g),在浸麥階段(0～24 h),泡沫蛋白質(zhì)的含量急劇下降,之后呈逐漸上升的趨勢(shì)。由于提取液中的泡沫蛋白質(zhì)主要來自大麥糊粉層,浸麥(0～24 h)階段一部分作為貯藏蛋白質(zhì)在發(fā)芽初期被水解,含量迅速下降,并為種子的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng);其他一些泡沫蛋白質(zhì)為種子在休眠期間抵御惡劣環(huán)境而以此穩(wěn)定結(jié)構(gòu)形式存在。在整個(gè)發(fā)芽過程中,兩種大麥的泡沫蛋白質(zhì)含量的變化基本相同,且高蛋白質(zhì)含量大麥的泡沫蛋白質(zhì)高于低蛋白質(zhì)含量大麥。

1～3,不同蛋白質(zhì)含量大麥熱穩(wěn)定性水溶蛋白質(zhì);4～6,不同蛋白質(zhì)含量大麥熱穩(wěn)定性鹽溶蛋白質(zhì)

1～3,不同蛋白質(zhì)含量大麥熱穩(wěn)定性醇溶蛋白質(zhì);4～6,不同蛋白質(zhì)含量大麥熱穩(wěn)定性堿溶蛋白質(zhì)

圖4 不同蛋白質(zhì)含量大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.2.2 大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜分析

從泡沫蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜中觀察到:發(fā)芽24 h泳道條帶數(shù)目較原大麥的蛋白條帶數(shù)量明顯減少、且顏色淡,說明泡沫蛋白質(zhì)的種類和含量均有所減少,這可能是受到部分蛋白酶水解作用或某些酶原的修飾,從而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化不再耐熱,在熱處理時(shí)發(fā)生絮凝,產(chǎn)生沉淀。發(fā)芽階段(48～120 h)泳道顏色逐漸加深,與Bradford法測(cè)定的泡沫蛋白質(zhì)含量的變化一致。

電泳圖譜(圖5)中40 ku左右的條帶為蛋白質(zhì)Z;10 ku左右的條帶主要為L(zhǎng)TP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì),重要的啤酒泡沫蛋白質(zhì))。在大麥萌發(fā)過程中,蛋白質(zhì)Z含量不斷增加。在整個(gè)大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在40 ku左右與5.0～20.0 ku兩部分。從圖5中對(duì)比發(fā)現(xiàn),兩個(gè)大麥在萌發(fā)過程中泡沫蛋白質(zhì)的組成與變化基本相同。因此大麥發(fā)芽過程中的泡沫蛋白質(zhì)的組成和相對(duì)含量,可以用來指示和預(yù)測(cè)其所制成的啤酒泡沫穩(wěn)定性及持泡性,從而預(yù)測(cè)啤酒品質(zhì),并進(jìn)而通過對(duì)大麥發(fā)芽過程中的影響因素的改進(jìn)來提升啤酒質(zhì)量和價(jià)值。

(a) 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.4%的大麥

(b) 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.5%的大麥

3 結(jié) 論

考察了同品種不同蛋白質(zhì)含量的3種大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量及其組成,發(fā)現(xiàn)大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量與大麥總蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān),大麥間熱穩(wěn)定醇溶蛋白質(zhì)含量差別最大且含量最高;雖然熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量不同但其組成基本相同。熱穩(wěn)定性水溶蛋白質(zhì)主要由分子質(zhì)量約40與5～15 ku兩部分組成,熱穩(wěn)定性鹽溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在72、57、40與5～23 ku四部分,熱穩(wěn)定性醇溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在94、60、29～54與5～15 ku四部分,熱穩(wěn)定性堿溶蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在94、60、50、40與5～23 ku五部分。

對(duì)低蛋白質(zhì)含量與高蛋白質(zhì)含量大麥發(fā)芽過程中泡沫蛋白質(zhì)的含量及組成的變化情況進(jìn)行測(cè)定與分析,結(jié)果顯示高蛋白質(zhì)含量大麥中的泡沫蛋白質(zhì)含量略高于低蛋白質(zhì)含量的大麥。在整個(gè)大麥萌發(fā)過程中,兩個(gè)大麥的泡沫蛋白質(zhì)含量的變化及組分基本相同,且高蛋白質(zhì)含量大麥的泡沫蛋白質(zhì)高于低蛋白質(zhì)含量大麥。

大麥熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)及泡沫蛋白質(zhì)組分在大麥總氮的變化過程中無明顯的變化,但其熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)和泡沫蛋白質(zhì)的含量與大麥中總氮呈正相關(guān),這為進(jìn)一步考察不同品種相同蛋白質(zhì)含量大麥中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變化規(guī)律奠定了基礎(chǔ),為評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)麥芽和啤酒泡沫的品質(zhì)特性提供借鑒。

[1] HEJARAAD J, KAERGAARD P. Purification and properties of major antigenic beer protein of barley origin [J]. Journal of the Institute of Brewing, 1983, 89(6):402-410.

[2] PERROCHEAU L, POGNIAUX H, BOIVIN P, et al. Probing heat-stable water-soluble proteins from barley to malt and beer[J]. Proteomics, 2005, 5(11):2849-2858.

[3] EVANS D E, SHEEHAN M C. Don't be fobbed off the substance of beer foam [J]. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2002, 60(2):47-57.

[4] 黃上志,王冬梅,盧春斌,等. 萌發(fā)中花生胚軸的耐干性與熱穩(wěn)定蛋白[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 1999, 25(2):193-198.

[5] EVANS D E, HEJARAD J. The impact of malt derived proteins on beer foam quality. Part I:the effect of germination and kilning on the level of protein Z4, protein Z7 and LTP1[J]. Journal of the Institute of Brewing, 1999, 105(3):129-158.

[6] 孫俊,張?zhí)煅?孫麗華,等. 大麥發(fā)芽過程中熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變化及部分生化特性[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(3):223-227.

(SUN Jun, ZHANG Tian-xue, SUN Li-hua, et al. Characterization of heat-stable protein in germinating barley seeds[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2008, 27(3):223-227.)

[7] 陳霞,石維忱,趙淑娟,等. 不同品種大麥熱穩(wěn)定蛋白——蛋白質(zhì)Z與LTP蛋白耐熱溫度的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(5):32-35.