田 桐, 宋 建 國, 趙 慕, 魚 紅 閃, 金 鳳 燮

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學(xué) 化工與材料學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1是紅參中微量含有的人參稀有皂苷,具有抗癌[1-4]、抗血栓[5-6]和提高免疫力[7-8]等功效。紅參加工過程中,二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd等受熱或在微酸環(huán)境中,微量地轉(zhuǎn)化為20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1。人參二醇類皂苷Rb1等受熱時(shí),部分水解可生成20(S,R)-Rg3,20(S,R)-Rg3在20位碳上的-OH和22位碳上的-H進(jìn)一步脫水而在20位和22位碳之間形成雙鍵,產(chǎn)生反式和順式的異構(gòu)體,即Rg5和Rk1[9]。

目前,對單體皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1藥效的研究很少,主要是因?yàn)樯鲜鲈碥諉误w制備難度大,因此采用合理的方法分離得到20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1單體是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)室李海燕[10]用皂苷糖基的酯化方法拆分了20(S)-Rg3和20(R)-Rg3;大連化物所的李鵬等[11]利用2種異構(gòu)體在不同濃度的乙醇溶液中,利用溶解度的差異實(shí)現(xiàn)了20(S)-Rg3、20(R)-Rg3兩者的分離;但目前還沒有對20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1的分離形成系統(tǒng)性研究。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1混合物中各組分的溶解度不同,先分離出20(R)-Rg3;然后采用硅膠柱層析法分離20(S)-Rg3、Rg5和Rk1;進(jìn)一步采用結(jié)晶法,精制得到20(S)-Rg3、20(R)-Rg3單體。本論文對研究各組分的藥效及其結(jié)構(gòu)與藥效的關(guān)系很有意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1的混合物,人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1,由本實(shí)驗(yàn)室提供;薄層層析板Silica Gel 60-F254,德國Merck公司生產(chǎn);硅膠,青島海洋化工廠生產(chǎn);其他化學(xué)試劑均為分析純,天津科密歐公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 分離方法

為了獲得紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1的混合物中各組分單體,利用混合物中各組分溶解度的不同,先分離出20(R)-Rg3。然后采用硅膠柱層析法分離20(S)-Rg3、Rg5和Rk1皂苷。再采用重結(jié)晶法分別對已分離出的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3進(jìn)行精制。

1.2.1.1 硅膠柱層析法

將20(S)-Rg3、Rg5和Rk1混合物用甲醇溶解,加入80～100目硅膠,水浴蒸干,不斷攪拌,直至硅膠復(fù)為粉末狀。取300～400目硅膠作分離膠,在玻璃柱內(nèi)鋪放均勻后,裝入樣品膠,最上層置脫脂棉。先用氯仿通柱,再按照V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5的洗脫劑進(jìn)行洗脫,TLC檢測分離結(jié)果,將相同成分的洗脫液收集,濃縮蒸干。

1.2.1.2 20(S)-Rg3與20(R)-Rg3粗品的精制

為得到單體,采用重結(jié)晶法分別對已分離出的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3粗品進(jìn)行精制。

20(S)-Rg3粗品的精制:加入80%甲醇溶液,加熱攪拌使其充分溶解,自然冷結(jié)晶,過濾結(jié)晶,干燥后稱重。

20(R)-Rg3粗品的精制:加入吡啶與甲醇混合溶液,加熱攪拌使其充分溶解后,加水至濃度達(dá)到90%,自然冷結(jié)晶,過濾結(jié)晶,干燥后稱重。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 薄層層析法(TLC)檢測樣品中所含皂苷成分

將人參皂苷溶于甲醇中,微量點(diǎn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,點(diǎn)樣于薄層層析板,然后置于層析缸中展開,展開劑:V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5。用10%硫酸溶液加熱顯色。通過對照樣品斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)來確定樣品中所含皂苷成分。

1.2.2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定人參皂苷單體的純度

色譜儀,Waters 2695高效液相色譜分析儀,Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站對總皂苷進(jìn)行檢測。色譜條件,Knauer C18色譜柱(5 μm,250 mm×3 mm);流動相,乙腈(A)-水(B);0～20 min,20%A等度;20～31 min,20%A～32%A線性梯度;31～40 min,32%A～43%A線性梯度;40～70 min,43%A～100%A線性梯度;進(jìn)樣量,10 μL;柱溫,35 ℃;體積流量,0.6 mL/min;檢測波長,203 nm。將待測人參皂苷樣品用色譜甲醇溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,即為檢測樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 Rg3混合物的組分分析

為了確定紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1混合物的組成及其比例,采用HPLC檢測,結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看到,其混合物中20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5的峰面積比例依次為28∶12∶18∶42。

圖1 20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1混合物HPLC檢測圖

2.2 Rg3混合物的分離

Rg3混合物的分離是分兩步進(jìn)行的。根據(jù)混合物中各組分溶解度的不同,首先分離出20(R)-Rg3,然后采用硅膠柱層析法分離20(S)-Rg3、Rg5和Rk1。

30 g的Rg3混合物充分溶于微酸性溶液,過濾不溶物,干燥后得到20(R)-Rg3粗品7.40 g。余下母液中主要含有20(S)-Rg3、Rg5和Rk1,采用硅膠柱層析法對母液進(jìn)行分離。TLC檢測分離結(jié)果如圖2。由圖2可知,45～63瓶Rg5較純?yōu)閱吸c(diǎn),單獨(dú)收集,濃縮干燥。第55瓶開始,分離產(chǎn)物中出現(xiàn)Rg3,80～98瓶Rg3較純?yōu)閱吸c(diǎn),單獨(dú)收集,濃縮干燥。99瓶之后為Rg3及下方皂苷。甲醇洗脫余下皂苷。分離產(chǎn)品按號分別收集,結(jié)果如表1所示。

表1 人參皂苷洗脫收集表

從表1中可以看到,20(S)-Rg3、Rg5和Rk1混合物采用硅膠柱層析法分離后,得到10.9 g為單點(diǎn)的Rg3和6.05 g為單點(diǎn)的順反異構(gòu)體Rg5和Rk1混合物。HPLC檢測發(fā)現(xiàn),得到的Rg3中20(S)-Rg3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.3%;得到的順反異構(gòu)體Rg5和Rk1的混合物中Rg5質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.4%,Rk1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.0%。順反異構(gòu)體Rg5和Rk1混合物經(jīng)HPLC檢測結(jié)果如圖3所示。

2.3 20(S)-Rg3與20(R)-Rg3的精制

為得到20(S)-Rg3、20(R)-Rg3單體,采用重結(jié)晶法分別對已分離出的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3粗品進(jìn)行精制。

2.3.1 20(S)-Rg3的精制

稱取3 g硅膠柱層析法分離后得到的20(S)-Rg3,加入80%甲醇溶液,加熱攪拌使其充分溶解,自然冷結(jié)晶,過濾結(jié)晶,干燥后稱重。采用HPLC檢測結(jié)晶產(chǎn)品結(jié)果如圖4所示。

圖3 硅膠柱層析法分離得Rg5和Rk1混合物HPLC檢測圖

圖4 20(S)-Rg3結(jié)晶HPLC檢測圖

精制前3 g的20(S)-Rg3粗品中,20(S)-Rg3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.3%,20(R)-Rg3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.0%。由圖4可知,精制后,20(S)-Rg3結(jié)晶收集0.850 g,純度達(dá)95.1%。

2.3.2 20(R)-Rg3的精制

稱取3 g已分離得到的20(R)-Rg3粗品,加入吡啶與甲醇混合溶液,加熱攪拌使其充分溶解后,加水至體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%,自然冷結(jié)晶,過濾結(jié)晶,干燥后稱重。采用HPLC檢測結(jié)晶產(chǎn)品,結(jié)果如圖5所示。

圖5 20(R)-Rg3結(jié)晶HPLC檢測圖

精制前3 g的20(R)-Rg3粗品中,20(R)-Rg3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.9%,20(S)-Rg3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.74%。由圖5可知,精制后,20(R)-Rg3結(jié)晶收集1.98 g,純度為94.6%。

3 結(jié) 論

30 g紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1的混合物中分離單體,由于其混合物的溶解度不同,先分離出7.40 g純度為64.0%的20(R)-Rg3粗品。然后采用硅膠柱層析法分離10.9 g純度為75.3%的20(S)-Rg3及6.05 g的順反異構(gòu)體Rg5和Rk1的混合物。再采用重結(jié)晶法分別對已分離出的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3粗品各3 g進(jìn)行精制,得到1.98 g純度為94.6%的20(R)-Rg3和0.850 g純度為95.1%的20(S)-Rg3。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在甲醇溶液中,20(R)-Rg3的溶解度遠(yuǎn)小于20(S)-Rg3、Rg5和Rk1,尤其是在90%甲醇水溶液中最低,加入助溶劑吡啶,更有利于得到高純度的20(R)-Rg3單體。但20(S)-Rg3、Rg5和Rk1在甲醇溶液中溶解度相近,在混合物中三者質(zhì)量分?jǐn)?shù)差不多時(shí),很難通過重結(jié)晶法得到高純度的20(S)-Rg3。因此,采用硅膠柱層析法先分離出含量較高的20(S)-Rg3,再多次采用重結(jié)晶法,才可得到20(S)-Rg3單體。至于拆分順反異構(gòu)體Rg5和Rk1,在人參二醇類皂苷Rb1等部分水解得到的二者混合物中,Rg5含量明顯高于Rk1,但如何進(jìn)一步精制得到單體,仍需進(jìn)一步研究。

本論文從紅參稀有皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5和Rk1的混合物中分離得到高純度的20(S)-Rg3單體,20(R)-Rg3單體及順反異構(gòu)體Rg5和Rk1的混合物,簡便快速,為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了新的思路。但有關(guān)拆分順反異構(gòu)體Rg5和Rk1的單體的方法,仍需進(jìn)一步研究。

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