張 秀 云， 吳 斌， 肇 慧 君， 賈 赟， 劉 霞， 張 瑞

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034;2.遼寧出入境檢驗檢疫局， 遼寧 大連 116001;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002 )

0 引 言

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。近年來，PRRS在我國存在不同程度的流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。自PRRSV在北美發(fā)現(xiàn)以來，圍繞其準(zhǔn)確診斷與疫苗的研究不斷深入。但由于PRRSV基因組具有較大的變異性[2]，為研究帶來一定的難度。

PRRSV系單股正鏈RNA病毒，該病毒的基因組長約15 kb。PRRSV的核衣殼N蛋白最為保守，是該病毒免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白[3]，也是目前進(jìn)行PRRS診斷的抗原基礎(chǔ)。感染PRRSV后的早期免疫應(yīng)答主要是針對N蛋白的，對其產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間也最長，N蛋白以其強(qiáng)大的免疫性和相對的保守性成為現(xiàn)行診斷試驗的抗原基礎(chǔ)，也是研制重組診斷抗原的首選靶抗原[4]。

本實驗對PRRSV的N蛋白基因(ORF7)[5]進(jìn)行克隆、測序鑒定、原核表達(dá)及純化，純化后的重組蛋白和PRRSV陽性血清進(jìn)行免疫學(xué)印跡試驗(Western-blotting)，驗證表達(dá)蛋白的免疫學(xué)活性，為下一步血清學(xué)檢測方法的建立和診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌種與毒株

Marc-145細(xì)胞及PRRSV ATCC VR2332標(biāo)準(zhǔn)毒株凍干樣品由遼寧出入境檢驗檢疫局動檢實驗室提供；pET-28a(+)、Ni-NTA His Bind Resis購自Novagen公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)宿主菌、pMD18-T載體均購自大連寶生物公司；巴氏小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試 劑

DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司出品；新生犢牛血清購自杭州四季青公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶AMV購自大連寶生物公司；一抗為自制鼠抗PRRSV抗體；二抗(羊抗鼠IgG-HRP)購自SIGMA公司；病毒RNA/DNA快速純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的PRRSV VR2332株的核衣殼ORF7基因序列，采用Oligo 6.0軟件自行設(shè)計引物，由大連寶生物公司合成，擴(kuò)增完整的ORF7基因序列。

P1：5′-GCCGAATTCATGCCAAATAACAAC-3′

EcoRI

P2：5′-AATCTCGAGTCATGCTGAGGGTGA-3′

XhoI

擴(kuò)增目的片段長度為372 bp。

1.4 PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株的增殖

MARC-145細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)貼壁長滿單層后，棄培養(yǎng)基，按病毒液與維持液(含2%小牛血清的DMEM)1∶10的比例，接種PRRSV VR2332標(biāo)準(zhǔn)毒株凍干樣品稀釋液，37 ℃吸附1 h，加入維持液后置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)70%以上病變時收獲病毒。凍融3次后的細(xì)胞培養(yǎng)液作為提取PRRSV的RNA的材料，RNA提取方法按Trizol法進(jìn)行。

1.5 ORF7基因片段擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得目的基因。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃，1 h；95 ℃，15 min。

PCR條件：94 ℃，5 min； 94 ℃，45 s；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，按膠回收試劑盒說明書回收特異性目的片段。

1.6 ORF7基因片段的克隆、鑒定和測序

將回收的N基因片段與pMD-18T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-N。pMD18T-N轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐平板，置37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含50 μg/mL氨芐青霉素的液體LB中過夜培養(yǎng)。按試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoRI、XhoI酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD-18T-N，核酸電泳檢查插入片段的大小，然后對pMD-18T-N進(jìn)行測序。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切的ORF7基因片段與表達(dá)載體pET-28a(+) 進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那霉素平板，置37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含50 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)振蕩過夜培養(yǎng)。按試劑盒提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定，篩選到陽性重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N。

1.8 陽性重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)

將pET-28a(+)-N轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑取單菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，菌液以1∶100比例接種于含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h，至OD600值達(dá)到0.6時，分別在30、37 ℃培養(yǎng)溫度下，加入不同終濃度的IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，其間每隔1 h取1 mL菌液進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.9 重組蛋白的純化及免疫學(xué)活性檢測

將在37 ℃，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h的500 mL菌液離心沉淀，用8 mL Denaturing Binding Buffer(8 mol/L Urea，20 mmol/L Na2HPO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.8) 重懸，將其置于冰浴中超聲破碎12 min。5 000 r/min離心15 min，獲取上清待用。另取20 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

用Ni-NTA層析柱在變性條件下純化重組蛋白。Ni-NTA resin經(jīng)裝柱、平衡、上樣后，依次洗脫、收集、透析復(fù)性。收集的蛋白在-80 ℃保存?zhèn)溆?。按Western-blotting方法鑒定表達(dá)蛋白免疫學(xué)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒增殖

將PRRSV ATCC VR2332病毒接種于Marc-145細(xì)胞上，在72 h出現(xiàn)約70%的細(xì)胞病變，如圖1所示。

圖1 Marc-145細(xì)胞接毒后病變情況

2.2 PRRSV ORF7基因片段擴(kuò)增

以RT-PCR獲得的CDNA為模板擴(kuò)增完整ORF7基因片段，大小為372 bp，與預(yù)計相符。如圖2所示。

M，DL2000 Marker；1、2，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3，陰性對照

圖2 PRRSV VR2332標(biāo)準(zhǔn)株ORF7基因的RT-PCR擴(kuò)增

Fig.2 RT-PCR amplification for ORF7 gene of PRRSV VR2332

2.3 重組質(zhì)粒pMD-18T-N的酶切鑒定和測序分析

將PCR產(chǎn)物連接入pMD-18T載體，用EcoRI、XhoI雙酶切鑒定，選取酶切出現(xiàn)約2.7 kb和372 bp大小的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒，挑取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。

用DNA star軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，并與美洲株VR2332、歐洲株LV和國內(nèi)數(shù)株參考毒株ORF7基因序列進(jìn)行比較分析。其基因與氨基酸同源性比較結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，測序基因與VR2332株ORF7基因序列同源性為100%，與LV株ORF7基因序列同源性為65.1%。氨基酸同源性比較中，本實驗室毒株與VR2332株ORF7同源性為100%，與LV株氨基酸同源性為58.5%，并與大部分國內(nèi)PRRSV毒株氨基酸序列同源性較高。

2.4 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N的鑒定

以特異性引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N，核酸電泳顯示出現(xiàn)大小為372 bp的ORF7基因片段。陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRI及XhoI雙酶切，出現(xiàn)5 324 bp和372 bp兩條帶，說明ORF7基因被定向插入到表達(dá)載體pET-28a(+)內(nèi)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N，如圖3所示。

表1 測序基因與國內(nèi)外其他毒株N基因和氨基酸同源性比較

M1，DL2000 DNA Marker；1，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N的EcoRI和XhoI的雙酶切；2，陰性對照；M2，DL15000 DNA Marker

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N酶切鑒定

Fig.3 The identification of pET-28a(+)-N

2.5 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化

SDS-PAGE電泳顯示，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)胞中，在0.2 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h時，PRRSV核衣殼重組蛋白在BL21細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)，大小約為22 ku，與預(yù)期相符。重組蛋白經(jīng)His-bind Purification Kit親和層析柱純化、透析復(fù)性，12%的SDS-PAGE電泳顯示獲得單一純化蛋白。結(jié)果如圖4所示。

2.6 重組蛋白免疫原性Western-blotting分析

以自制鼠抗PRRSV全病毒的陽性血清作為一抗，對誘導(dǎo)表達(dá)的原核重組N蛋白進(jìn)行Western-blotting檢測。結(jié)果在大小約22 ku處出現(xiàn)一清晰的特異性反應(yīng)條帶，而宿主菌空載體pET-28a(+)無此條帶。表明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并保留了與PRRSV陽性血清反應(yīng)的抗原性，結(jié)果如圖5所示。因此，本實驗制備的重組蛋白可用來建立PRRS的血清學(xué)檢測方法。

1，pET-28a(+)/BL21誘導(dǎo)后的菌體總蛋白； 2，pET-28a(+)-N/BL21誘導(dǎo)后的菌體總蛋白； M，低分子質(zhì)量蛋白Marker；3，純化后重組蛋白；4，復(fù)性后重組蛋白

圖4 重組蛋白pET-28a(+)-N表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expression by pET-28a(+)-N

1，pET-28a(+)/BL21誘導(dǎo)后的菌體總蛋白；2，pET-28a(+)-N/BL21誘導(dǎo)后的菌體總蛋白； M，低分子質(zhì)量蛋白Marker；3，純化后的重組蛋白；4，復(fù)性后的重組蛋白

圖5 重組蛋白pET-28a(+)-N的Western-blotting檢測

Fig.5 Western-blotting analysis of the recombinant protein expression by pET-28a(+)-N

3 結(jié) 論

本研究使用的PRRSV ATCC VR2332是豬繁殖與呼吸綜合征美洲型病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株，與GenBank中PRRSV VR2332 N基因進(jìn)行比對符合率為100%，與國內(nèi)毒株N基因?qū)Ρ确下室捕驾^高。這對于建立具有臨床普遍意義的PRRSV檢測方法具有重要意義。將PRRSV株0RF7基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，以期獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-N，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下獲得了高效表達(dá)。將純化復(fù)性后的重組N蛋白與抗PRRSV全病毒陽性血清進(jìn)行Western-blotting鑒定，結(jié)果重組N蛋白與PRRSV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)的重組N蛋白具有較好的反應(yīng)活性。

制備的重組N蛋白，與全毒檢測的方法相比，可以克服散毒這一弊端，只需通過簡單的溫度誘導(dǎo)就可獲得大量的重組表達(dá)。通過Ni-NTA柱的純化和透析復(fù)性后，重組蛋白的純度大大提高，并且抗原性更佳，可用做診斷抗原。這為利用該原核表達(dá)產(chǎn)物建立反應(yīng)機(jī)體抗體水平的特異性診斷方法提供了基礎(chǔ)材料。

[1] 蔡雪輝. 我國豬繁殖與呼吸綜合征的流行特點、分布規(guī)律與防制策略 [J]. 吉林畜牧獸醫(yī)， 2002(4)：6-7,17.

[2] DENAC H, MOSER C, TRATSH J D, et al. An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen[J]. Journal of Virological Methods,1997, 65(2):169-181.

[3] WISSINK E H J, WIJK H A R, KROESE M V, et al. The major envelope protein GP5 of a European porcine reproductive and respiratory syndrome virus contains a neutralization epitope in its N-terminal ectodomain[J]. Journal of General Virology, 2003, 84(6):1535-1543.

[4] SEUBERLICH T, TRATSCHIN J, THUR B, et al. Nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection and differentiation of antibodies against European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2002, 9(6):1183-1191.

[5] PIRZADEH B, DEA S. Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Journal of General Virology, 1998, 79(5):989-999.