陳 嬌 嬌， 孫 鍵， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物。按其品質(zhì)情況及產(chǎn)地和生長環(huán)境不同，把人參分為野山人參、園參和高麗參3個品種[1]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參有抗心律失常，抗衰老的作用，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)人參的有效成分還具有抗腫瘤作用[2]。人參皂苷是人參中主要有效成分, 具有人參的主要生理活性，具有極高的藥用價值和應用前景。

人參皂苷C-K在天然的人參中并不存在，是其他二醇型人參皂苷在腸道內(nèi)的降解產(chǎn)物和最終吸收形式，人參的許多生物學活性是由該化合物引起的,特別是抗衰老、改善記憶、抗腫瘤等方面都體現(xiàn)了良好的藥效[3]。人參皂苷Rb1在人參中的含量較高，大約1%～3%，它和稀有皂苷C-K具有相同的母環(huán)結構。因此，可通過酶法將人參皂苷Rb1C-3位的兩個—Glc鍵和C-20位的一個—Glc鍵水解，得到稀有皂苷C-K。目前，國內(nèi)在這方面的研究較少。本研究采用實驗室前期工作中篩選得到的Absidiasp.G8r菌株，該菌種通過液態(tài)發(fā)酵可得到一種人參皂苷糖苷酶，該酶能夠水解人參皂苷Rb1生成稀有皂苷C-K，作者首先對這種人參皂苷糖苷酶進行了分離純化，然后對該酶的性質(zhì)和水解作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種Absidiasp.G8r，由大連工業(yè)大學生物與食品工程學院菌種保藏室提供；薄層層析板Silica；人參皂苷Rb1、Rd、F2、Compound K(C-K)等標準品,實驗室自制。

1.1.1 培養(yǎng)基的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：

(1)稱取100 g人參粉和300 mL水倒入燒杯中，文火加熱，熬煮7 h，加熱中注意補水。

(2)待冷卻后，紗布過濾，濾液于7 000 r/min下離心10 min，取上清液，補水至200 mL制成人參浸出液。

(3)取人參浸出液12 mL加入10°的麥芽汁48 mL，再加40 mL水補齊到100 mL，制成人參皂苷糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃濕熱滅菌，待用[4]。

1.2 方 法

1.2.1 微生物的液體發(fā)酵及粗酶液的制備

取制備好的培養(yǎng)基100 mL，接菌2～3環(huán)，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4～5 d。

將培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在8 000 r/min下離心15 min，取上清液在磁力攪拌條件下加入適量硫酸銨粉末調(diào)飽和度至75%，放入冰箱4 ℃下靜置12 h后，在13 000 r/min下離心20 min。棄上清液，將沉淀用20 mmol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解后，倒入透析袋中，在緩沖液中透析24 h。透析結束后，在13 000 r/min下冷凍離心10 min，上清液即為粗酶液，放人冰箱內(nèi)，保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 人參皂苷糖苷酶的分離純化及分子質(zhì)量的測定

取8 mL粗酶液，采用DEAE-Cellulose DE52陰離子交換柱(2.0 cm×10.5 cm)進行分離純化[5]，最后得到純化后的人參皂苷糖苷酶。

將得到的樣品處理后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法[6]，進行酶的純度與分子質(zhì)量檢測。

1.2.3 酶活力的測定

用0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液分別溶解人參皂苷 Rb1、Rd、F2，制成質(zhì)量濃度均為5 g/L 的標準品溶液為酶作用的底物。

在酶性質(zhì)研究中，以人參皂苷Rb1為底物生成人參皂苷C-K的酶活力測定：取0.1 mL 人參皂苷Rb1標準品溶液，加入酶液0.1 mL，在30 ℃溫度下，反應22 h后，加入水飽和正丁醇0.2 mL，終止酶反應，經(jīng)振蕩、分層后，取上清液10 μL作薄層層析檢測，展開，顯色后立即掃描并復印。應用Band-scan工具軟件，對TLC圖譜進行產(chǎn)物含量分析[7]。

酶活力的定義：在30 ℃下反應22 h后，每小時生成1 nmol人參皂苷C-K所需的酶量即一個酶活力單位。

相對酶活力：底物轉化成產(chǎn)物的轉化率。

在酶反應過程研究中，以人參皂苷Rb1為底物生成Rd的酶活力測定：取0.1 mL人參皂苷Rb1標準品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反應8 h，然后用0.2 mL水飽和正丁醇終止反應，進行產(chǎn)物含量分析。酶活力的定義：在30 ℃下反應8 h條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷Rd所需的酶量即一個酶活力單位。

以人參皂苷Rd為底物生成F2的酶活力的測定：取0.1 mL人參皂苷Rd標準品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反應10 h，然后用0.2 mL水飽和正丁醇終止反應，進行產(chǎn)物含量分析。酶活力的定義：在30 ℃反應10 h條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷F2所需的酶量即一個酶活力單位。

以人參皂苷F2為底物生成C-K的酶活力的測定：取0.1 mL 人參皂苷F2標準品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反應8 h，然后用0.2 mL水飽和正丁醇終止反應，進行產(chǎn)物含量分析。酶活力的定義：在30 ℃反應8 h條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷C-K所需的酶量即一個酶活力單位。

1.2.4 薄層層析(TLC)

人參皂苷糖苷酶的酶反應結果采用TLC法進行檢測,展開劑為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5;顯色條件：噴10%的H2SO4水溶液，然后在105 ℃下加熱10 min顯色。

1.2.5 酶性質(zhì)的研究

研究純化后得到的人參皂苷糖苷酶的酶反應條件。測定酶反應的pH值、酶反應的溫度、金屬離子對酶反應的影響。

1.2.6 酶水解作用的研究

分別取人參皂苷糖苷酶與底物人參皂苷Rb1各100 μL,于30 ℃下反應2、4、6、8、10、12、14、16、18、22、24、36、48、60、72 h。結果用TLC進行檢測。

如圖3所示，時間同步電路從北斗/GPS接收機接收兩路信號，分別是串口(或網(wǎng)絡)數(shù)據(jù)信號以及秒脈沖信號。鑒于雷達系統(tǒng)內(nèi)部電磁環(huán)境復雜，存在高電壓、大電流設備，會對授時數(shù)據(jù)信號和秒脈沖信號的傳輸產(chǎn)生干擾。工程設計上，分別從硬件和軟件兩方面采取措施，避免和濾除干擾，對授時數(shù)據(jù)和秒脈沖信號加以保護。

1.2.7 酶反應的動力學常數(shù)Km及最大反應速度Vmax

首先配制不同濃度的底物溶液。將酶液與不同濃度的底物溶液等比例混合后在pH 5.0、30 ℃條件下反應，反應結束后對酶活力進行測定，根據(jù)測定結果，采用Lineweaver-Burk作圖，得到米氏方程、最大反應速率、米氏常數(shù)。

2 結果與討論

2.1 人參皂苷糖苷酶的分離純化及分子質(zhì)量的測定

將發(fā)酵培養(yǎng)后得到的粗酶液采用DEAE-CelluloseDE52離子交換柱層析進行分離、提純，用自動部分收集器對洗脫液進行收集，采用鹽梯度細化、把純化的酶液回收重新上柱等技術手段，對酶液進行反復的純化，最終得到提純的人參皂苷糖苷酶，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白檢測，結果見圖1。計算出人參皂苷糖苷酶的分子質(zhì)量約為72 ku。

圖1 人參皂苷糖苷酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 人參皂苷糖苷酶的酶性質(zhì)的研究

2.2.1 pH對酶反應的影響

在30 ℃下，反應22 h，反應pH 分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0時測定剩余酶活力，得到酶的最適pH曲線。

將酶液分別在pH 2.2～10.0條件下，室溫放置30 min后，酶反應在最適pH 5.0、30 ℃的條件下進行，對剩余酶活力進行檢測后，得到酶的pH穩(wěn)定性曲線。結果如圖2所示。由圖2可以看出，在pH 5.0時，人參皂苷糖苷酶的酶反應轉化率達到最高，相對酶活力在pH 3.0～7.0達到50% 以上，而相對酶活力在pH 小于3.0或大于7.0時都有明顯減退。因此，確定該酶的酶反應最適pH為5.0，在pH 3.0～7.0酶活力相對穩(wěn)定。

圖2 最適pH及pH穩(wěn)定性曲線

2.2.2 溫度對酶反應的影響

在20～80 ℃下將酶液分別熱處理30 min，然后迅速冷卻到室溫，處理后的酶液在最適的測活體系(pH 5.0，30 ℃)中檢測剩余酶活力，確定酶的溫度穩(wěn)定性,結果如圖3所示。

圖3 最適溫度及溫度穩(wěn)定性曲線

由圖3可見，隨著溫度的升高，酶活力逐漸增大，在30 ℃ 下的酶反應，酶活力達到最大值;溫度繼續(xù)升高，酶活力迅速下降，在80 ℃下的酶反應，酶活力幾乎完全喪失。因此，確定人參皂苷糖苷酶的最適酶反應溫度為30 ℃，在20～60 ℃ 下酶的穩(wěn)定性較好。

2.3 人參皂苷糖苷酶的反應過程的研究

分別取人參皂苷糖苷酶與底物人參皂苷Rb1各100 μL，于30 ℃下反應2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72 h，TLC結果如圖4所示。由圖4可知，酶反應開始，隨著時間的進行，人參皂苷Rb1逐漸減少，生成Rd；大約10 h， Rd逐漸減少，生成F2；在18 h，F(xiàn)2逐漸減少，生成C-K。反應72 h后，幾乎所有的人參皂苷Rb1都被水解。所以人參皂苷糖苷酶水解人參皂苷Rb1的過程為Rb1→Rd→F2→C-K。結構圖如圖5所示。由圖5可知，整個酶反應的過程是單個酶的多步反應。人參皂苷Rb1、Rd、F2、C-K具有相同的母環(huán)結構，在C-3、C-20位連接不同的糖苷鍵，該人參皂苷糖苷酶先水解Rb1C-20位的(1-6)Glc鍵，生成Rd；再水解Rd C-3位的(1-2)Glc鍵，生成F2；再水解F2C-3位的Glc鍵，最后得到C-K。

圖5 酶水解Rb1生成C-K的轉化過程圖

2.4 酶反應動力學常數(shù)Km及最大反應速率Vmax

以Rb1為底物，配成不同濃度S，取100 μL酶液與不同濃度的底物溶液，在30 ℃ 下反應8 h后，測定酶活力，酶活力的定義：在30 ℃反應8 h的條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷Rd的酶量即一個酶活力單位。依據(jù)測定結果，采用Lineweaver-Burk作圖，結果如圖6所示。由圖6可見，依據(jù)測定結果，得到米氏方程：1/V=6.436/S+0.656，最大反應速率Vmax=1.524 mmol/(L·h)，米氏常數(shù)Km=5.495 mmol/L。以Rd為底物，配成不同濃度S，分別取100 μL酶液與不同濃度的底物溶液，在30 ℃ 下反應10 h后，測定酶活力，酶活力的定義：在30 ℃反應10 h的條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷F2的酶量即一個酶活力單位。依據(jù)測定結果，采用Lineweaver-Burk作圖，結果如圖7所示。

圖6 人參皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

Fig.6 Lineweaver-Burk plot of ginsenoside-glyosidase

圖7 人參皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

由圖7可見，依據(jù)測定結果，得到米氏方程：1/V=6.07/S+1.106，最大反應速率Vmax=0.904 mmol/(L·h)，米氏常數(shù)Km=5.488 mmol/L。

以F2為底物，配成不同濃度S，取100 μL酶液與不同濃度的底物溶液，在30 ℃ 下反應8 h后，測定酶活力，酶活力的定義：在30 ℃反應8 h的條件下，每小時生成1 nmol人參皂苷C-K的酶量即一個酶活力單位。依據(jù)測定結果，采用Lineweaver-Burk作圖，結果如圖8所示。

圖8 人參皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

由圖8可見，依據(jù)測定結果，得到米氏方程：1/V=11.661/S+2.254，最大反應速率Vmax=0.447 mmol/(L·h)，米氏常數(shù)Km=5.176 mmol/L。

3 結 論

通過對Absidiasp.G8r菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到了一種能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1水解，生成稀有人參皂苷C-K的人參皂苷糖苷酶。該酶的蛋白分子質(zhì)量約為72 ku，酶反應的最適pH值為3.0，在pH 3.0～7.0酶活力較穩(wěn)定；最適酶反應溫度為30 ℃ ，在20～60 ℃下酶活力穩(wěn)定性較好。該酶水解人參皂苷Rb1生成稀有皂苷C-K的過程是單個酶的多步反應，酶首先水解Rb1生成Rd；大約在8 h，酶水解Rd生成F2；在18 h，酶水解F2生成C-K。并對整個過程的酶反應動力學進行研究，最大反應速率分別為1.524、0.904、0.447 mmol/(L·h)，米氏常數(shù)分別為5.488、5.176、5.495 mmol/L。以上研究結果為今后研究酶法水解人參皂苷側鏈糖基，制備高活性皂苷，提供了理論依據(jù)。

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