潘宏升，田素飛，年華，褚云卓

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽110001)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行病學(xué)研究

潘宏升，田素飛，年華，褚云卓*

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽110001)

了解我院患者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。收集2007年1月～2008年9月我院分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌共54株，采用PCR進(jìn)行SCCmec基因分型、葡萄球菌A蛋白(SPA)分型，并檢測殺白細(xì)胞毒素(PVL)基因，同時(shí)應(yīng)用脈沖場凝膠電泳(PFGE)進(jìn)行同源性分析。54株MRSA菌株SCCmec基因分型為SCCmecⅡ型17株，SCCmecⅢ型33株，SCCmecⅣ型2株，SCCmecⅤ型2株;SPA基因分型將28株歸屬為t030，9株為t002，8株為t037，5株為t570，2株為t437，t163和t796各1株;PVL毒素檢測只有2株SCCmecⅣ型菌株陽性;PFGE證實(shí)院內(nèi)MRSA感染主要為2種克隆株傳播，同時(shí)還有其他型別出現(xiàn)。本院MRSA流行傳播的SCCmec基因型主要以Ⅲ型占優(yōu)勢，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有攜帶PVL毒素的CA-MRSA分離株流行，應(yīng)引起密切關(guān)注。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;基因分型;殺白細(xì)胞毒素

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是臨床非常重要的病原菌，具有多重耐藥性和潛在的致死性等特點(diǎn)，存在局部暴發(fā)流行的潛在威脅，是臨床抗感染治療的難題之一，目前已成為醫(yī)院和社區(qū)的常見致病菌，嚴(yán)重威脅著人類的健康。MRSA的耐藥性往往與其攜帶多種耐藥基因有關(guān)，其中攜帶葡萄球菌基因盒(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)的移動(dòng)基因元件為其主要原因，SCCmec基因又存在不同亞型［1］。因此，了解MRSA的基因分型對臨床治療及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。分子流行病學(xué)研究方法在揭示病原菌的遺傳進(jìn)化規(guī)律，確定某一感染暴發(fā)流行菌株的基因同源性，調(diào)查院內(nèi)耐藥性質(zhì)粒在不同菌群間播散等方面發(fā)揮重要作用。本文應(yīng)用SCCmec基因分型、SPA分型及脈沖場凝膠電泳(PFGE)等方法對中國醫(yī)科大學(xué)分離的MRSA進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2007年1月至2008年9月門診及住院患者連續(xù)分離、不重復(fù)非痰標(biāo)本MRSA菌株54株，mecA基因均陽性，其中血標(biāo)本14份，創(chuàng)口分泌物13份，膿汁10份，靜脈導(dǎo)管8份，留置管6份，引流液2份，便1份。

1.1.2 主要試劑及儀器細(xì)菌基因組提取試劑盒，博日生物技術(shù)有限公司;Taq酶及PCR相關(guān)試劑，寶泰克大連生物科技有限公司;PCR所有引物，上海生工有限公司合成;脈沖場凝膠電泳試劑盒，美國Bio-Rad生物科技有限公司。HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱(上海);超速低溫離心機(jī)(貝克曼); PCR9700(Gene Amp);脈沖場凝膠電泳儀(Bio-Rad);紫外凝膠成像儀(Alpha Innotech)。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，按照說明提取基因組DNA。

1.2.2 SCCmec基因分型引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)等參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行，ClassB上游引物5'-TATTTTTGGGTTTCACTCGG-3'，下游:5'-CTCCACGTTAATTCCATTAATACC-3';ClassC上游引物:5'-GAACATTGTTACTTAAATGAGCG-3'，下游引物:5'-TGAAAGTTGTACCCTTGACACC-3'; Type2上游引物:5'-ATTGCCTTGATAATAGCCTCT-3'，下游引物:5'-TAA AGGCATCAATGCACAAACACT-3'。

1.2.3 PVL基因檢測引物設(shè)計(jì)及參數(shù)參照文獻(xiàn)［2］，上游引物:5'-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3'，下游引物:5'-GCATCAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3'。

1.2.4 SPA基因多態(tài)性分型引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［3］，上游引物:5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTG-3'，下游引物:5'-GACGATCCTTCGGTGAGC-3'。

1.2.5 基因序列分析目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增陽性，片段大小與預(yù)計(jì)值相符，產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司純化、測序，在GenBank上比對，確定為目的基因特征序列，其中SPA分型的測序結(jié)果于數(shù)據(jù)庫(http://www.ridom.de/spaserver/)中公布的重復(fù)序列進(jìn)行比較，根據(jù)排列方式及次數(shù)確定型別。

1.2.6 脈沖場凝膠電泳分析新鮮菌株包埋于1%低熔點(diǎn)瓊脂中，溶葡球菌素及溶菌酶進(jìn)行破壁(37℃，2 h)，蛋白激酶K原位消化(50℃，48 h)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI酶切(25℃、140 r/ min、4 h);參數(shù):電場強(qiáng)度6 V/cm，溫度14℃，角度120°，線性變化5～40 s，22 h，EB染色20 min，分析結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn):酶切后圖譜完全一致為A型;圖譜與A比較，3條帶差異以下者為同一型的不同亞型，4～6條者為不同基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCCmec基因分型結(jié)果

54株MRSA菌株分為SCCmecⅡ～Ⅴ型，其中SCCmecⅡ型17株(31.5%)、SCCmecⅢ型33株(61.1%)、SCCmecⅣ型2株(3.7%)及SCCmecⅤ型2株(3.7%)。

2.2 SPA基因多態(tài)性分型結(jié)果

根據(jù)重復(fù)序列出現(xiàn)的次數(shù)和排列方式不同，SPA基因分型分為7個(gè)型，其中28株(51.9%)為t030型(r15-r12-r16-r02-r24-r24)、8株(14.8%)為t002型(r26-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)、8株(14.8%)為t037型(r15-r12-r16-r02-r25-r17-r24)、5株為t570型(r07-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)、2株(3.7%)為t437型(r04-r20-r17-r20-r17-r25-r34)、t163(r04-r20-r17-r20-r17-r45-r16-r34)和t796(r07-r23-r21-r17-r12-r23-r02-r12-r23)各1株(1.9%)。

表1 菌株間SCCmec與SPA基因型結(jié)果及其關(guān)系Table 1The relationship of Strain between SCCmec and SPA

2.3 PVL基因檢測

檢測結(jié)果只有2株SCCmecⅣ-t437型MRSA分離株P(guān)VL基因陽性，占臨床分離株的3.7%，其測序結(jié)果見圖1。

2.4 PFGE結(jié)果

染色體條帶電泳結(jié)果顯示我院MRSA感染為多克隆株傳播，至少存在4個(gè)克隆株，分別為A、B、C、D型，以A和B型為主，其中A型23株，B型19株，A型又分為A1和A2亞型，B型分為B1和B2亞型。電泳結(jié)果見圖2。

3 討論

MRSA已成為醫(yī)院和社區(qū)人群感染的常見病原菌，不但致病能力強(qiáng)，耐藥譜廣，而且對多種抗菌藥物的敏感性呈現(xiàn)逐年降低趨勢［5］，目前已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公眾健康的感染性因子之一，使臨床抗感染治療面臨極大困難，由此也成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

不同國家、不同地區(qū)間流行的MRSA基因型不同，Ko等［6］報(bào)道，亞洲地區(qū)除日本和韓國以SCCmecⅡ型為主外，其他9個(gè)國家醫(yī)院MRSA均以SCCmecⅢ型占優(yōu)勢，我國香港［7］、臺灣［8］地區(qū)的報(bào)道也以Ⅲ型為主。但目前國內(nèi)相關(guān)研究較少，2006年的一項(xiàng)國內(nèi)調(diào)查研究顯示，中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院MRSA感染以SCCmecⅡ型為主［9］，與日本、韓國的SCCmec基因型一致。本研究發(fā)現(xiàn)，中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院MRSA感染以SCCmecⅢ型占優(yōu)勢(占61.8%)，可見MRSA基因型存在由Ⅱ型向Ⅲ型轉(zhuǎn)變趨勢，目前，這種基因型轉(zhuǎn)變的趨勢尚未在其他國家和地區(qū)間出現(xiàn)，考慮到本地區(qū)間的基因型轉(zhuǎn)變可能與以下因素有關(guān):SCCmecⅢ型MRSA在不斷進(jìn)化，適應(yīng)能力在逐漸提高，生存能力在日益增強(qiáng);本研究標(biāo)本多來源于ICU、呼吸科、感染科等病房，其患者年齡多較大，有長期用藥史，抗菌藥物選擇壓力也是不容忽視的主要原因;隨著國家和地區(qū)間經(jīng)濟(jì)文化交流的日益頻繁，使得感染更具有復(fù)雜性和多樣性。諸多因素影響下的SCCmec基因型轉(zhuǎn)變使得臨床抗感染治療更為棘手。尤為重要的是，本地區(qū)2007年以來已經(jīng)出現(xiàn)了社區(qū)MRSA菌株(SCCmecⅣ型2株及SCCmecⅤ型2株)，雖然社區(qū)MRSA菌株的SCCmec基因結(jié)構(gòu)上僅攜帶對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥基因，但已有報(bào)道CA-MRSA對多重藥物敏感率呈逐年下降趨勢［5］，考慮后者可能涉及其他耐藥機(jī)制。本研究中，CA-MRSA對紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星及慶大霉素等也表現(xiàn)出不同程度耐藥，因此CA-MRSA的多重藥物敏感性已在下降，耐藥形勢不容樂觀。另外CA-MRSA菌株SCCmec片段相對小，未負(fù)載其他“額外”的耐藥基因，因此，非常利于廣泛傳播，較易造成大范圍的流行。

CA-MRSA不同于HA-MRSA的另一顯著特點(diǎn)是其毒力較強(qiáng)，常攜帶多種與致病力相關(guān)的外毒素，Vandenesch等［10］進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)所有117株社區(qū)MRSA均包含pvl基因，而醫(yī)院MRSA菌株pvl基因均未檢測出。此研究顯示pvl可能為社區(qū)基礎(chǔ)的MRSA病原體提供了選擇性的優(yōu)勢。本次研究中，2株SCCmecⅣ型CA-MRSA菌株pvl基因擴(kuò)增均陽性，而HA-MRSA的pvl基因擴(kuò)增均為陰性，回顧性分析2株CA-MRSA感染患者的臨床資料，均為門診患者，因皮膚軟組織感染而接受治療，尚無壞死性肺炎等致死性感染出現(xiàn)，目前有關(guān)CA-MRSA及pvl基因研究備受關(guān)注。

spa分型研究發(fā)現(xiàn)，2007年分離的SCCmecⅢ型MRSA菌株t030(r15-r12-r16-r02-r24-r24)，在2008年發(fā)生了基因重排，形成了克隆株t037(r15-r12-r16-r02-r25-r17-r24)。SCCmecⅡ型MRSA克隆株一直以t002(r26-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16重復(fù)單位長達(dá)10個(gè))為主，進(jìn)化緩慢，僅2007年出現(xiàn)了第一個(gè)重復(fù)單位內(nèi)的點(diǎn)突變，成為t570(r07-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16);在2008年出現(xiàn)基因重排，演變?yōu)閠3166(r26-r23-r17-r34-r17-r13-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)。SCCmecⅣ型的spa重復(fù)序列t437(r04-r20-r17-r20-r17-r25-r34)特征提示其不同的起源。SCC-mecⅤ型則包括2種spa型別t163及t796，值得注意的是SCCmecⅤ-t163(r04-r20-r17-r20-r17-r45-r16-r34)與SCCmecⅣ-t437型克隆株之間存在特殊的關(guān)聯(lián)模式。但目前關(guān)于spa基因型t796、t163報(bào)道較少，尚無法比較分析。

綜合SCCmec和spa 3種基因分型結(jié)果，MRSA并非以單一克隆株占優(yōu)勢，而由兩大克隆株(SCCmecⅢ-t030和SCCmecⅡ-t002)進(jìn)化而來，并且呈交替流行的趨勢，PFGE結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)果。因此了解MRSA的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為防控MRSA在醫(yī)院和社區(qū)中的出現(xiàn)和蔓延具有深遠(yuǎn)影響。

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Molecular Epidemiological Study on Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

PAN Hong-sheng，TIAN Su-fei，NIAN Hua，CHU Yun-zhuo
(Clin.Lab.Dept.of The First Hosp.of China Med.Uni.，Shenyang 110001)

Molecular epidemiological characteristics of patients suffered from methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)in the hospital were penetrated in order to provide foundation for anti-infective therapy.54 strains of MRSA isolated in the hospital during January 2007～September 2008 were collected and adopted polymerase chain reaction(PCR)carried out SCCmec and Staphylococcus A protein(SPA)genotyping，as well as Panton-Valentine leukocidin(PVL)gene detection，and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)homology analysis.The results showed that SCCmec gene typing among 54 MRSA strains SCCmecⅡwas 17 strains，SCCmecⅢ33 strains，SCCmecⅣ2 strains，SCCmecⅤ2 strains;and SPA genotyping get 28 MRSA attributed to t030，9 strains to t002，8 strains to t037，5 strains to t570，2 strains to t437，and each to t163，t796.The PVL toxin detection only two SCCmecⅣstrains were positive;Nosocomial infection of MRSA was confirmed primarily spread by two cloned strains which were proved by PFGE，while occurred other types emerged.Therefore，the prevalence and spread of MRSA in the hospital mainly dominated by SCCmecⅢgenotype;And it was found at the same time that PVL toxin-carrying isolates of CA-MRSA was epidemic that should be paid a close attention to.

methicillin-resistant;Staphylococcus aureus;genotyping;Panton-Valentine leukocidin

R378.1+1

A

1005－7021(2011)01－0034－05

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008225010-10)

潘宏升男，碩士研究生。研究方向?yàn)榧?xì)菌耐藥機(jī)制。E-mail:phs751@163.com

*通訊作者。E-mail:cyz6630@163.com

2010-11-17;

2011-01-12