鄭麗，孫曉丹，潘艷艷，馮輝，陳光，周泓旭，曹雅明*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng)110001; 3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，黑龍江佳木斯154000)

BALB/c小鼠感染不同瘧原蟲CD4+Th應(yīng)答和凋亡特點(diǎn)的比較研究

鄭麗1，孫曉丹2，潘艷艷1，馮輝1，陳光3，周泓旭1，曹雅明1*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng)110001; 3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，黑龍江佳木斯154000)

探討不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠的免疫應(yīng)答特點(diǎn)。BALB/c小鼠經(jīng)腹腔注射致死型約氏瘧原蟲(P.y17XL)和夏氏瘧原蟲(P.c AS)感染的紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率;ELISA動(dòng)態(tài)檢測(cè)感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾中CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量。約氏瘧原蟲(P.y17XL)感染早期，小鼠原蟲血癥持續(xù)上升;IFN-γ和IL-4分泌水平僅在感染后第3天出現(xiàn)一過(guò)性有意義的升高，而且峰值較低;脾中CD4+T細(xì)胞大量凋亡，小鼠全部死亡;而夏氏瘧原蟲(P.c AS)感染小鼠，原蟲血癥上升緩慢;IFN-γ分泌水平在感染后第5天達(dá)峰值;IL-4分泌水平在感染后第10天達(dá)峰值，且峰值較高維持時(shí)間較長(zhǎng);脾中CD4+T細(xì)胞凋亡細(xì)胞于感染后8 d出現(xiàn)有意義升高，小鼠全部存活?？汞懕Ｗo(hù)性免疫有賴于Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過(guò)渡，感染期間CD4+T細(xì)胞凋亡的時(shí)相和數(shù)量可能是影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度或引起宿主免疫抑制的原因，從而影響宿主瘧原蟲感染的結(jié)局。

BLAB/c小鼠;約氏瘧原蟲;夏氏瘧原蟲;Th應(yīng)答;凋亡

瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播的嚴(yán)重威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾病。2010年WHO報(bào)告，2009年全球瘧疾病例超過(guò)2億人，導(dǎo)致近百萬(wàn)患者死亡［1］，給全球尤其是發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)了沉痛的健康危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。隨著瘧疾疫苗的開發(fā)和抗瘧藥物的研究進(jìn)展，宿主對(duì)瘧原蟲的免疫機(jī)制的研究越來(lái)越成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。以往的研究顯示，在瘧疾感染早期Th1應(yīng)答的有效建立和后期Th1向Th2應(yīng)答的有序過(guò)渡是不同小鼠感染同種瘧原蟲出現(xiàn)治愈和死亡的原因［3］。在瘧疾感染早期，DC產(chǎn)生IL-12誘導(dǎo)IFN-γ分泌增加的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，并通過(guò)TNF-α及NOs遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖;隨之，由Th2型細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，有效清除瘧原蟲，防止復(fù)發(fā)和再燃［4-6］。本研究利用成功建立的約氏瘧原蟲(P.yoelii17XL，P.y17XL)和夏氏瘧原蟲(P.chabaudi AS，P.c AS)感染的BALB/c小鼠模型，對(duì)比觀察了宿主的感染模式、Th1和Th2型免疫應(yīng)答特點(diǎn)，特別是感染后宿主脾細(xì)胞CD4+T細(xì)胞凋亡的數(shù)量，以期為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雌性BALB/c小鼠，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證編號(hào):SCXK6京2004-0001。

1.1.2 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo);小牛血清(Biological Industries，Haemek，Israel); IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒(R＆D System，Minneapolis，MN);抗CD4-FITC單克隆抗體(GK1.5克隆)。Annexin-V-PE apoptosis detection kit(BD Pharmigen)。

1.1.3 主要儀器自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀，Model 450，Bio-rad產(chǎn)品;FACSCalibur流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACSean，美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 瘧原蟲及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染6～8周齡雌性BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106P.y17XL和P.c AS(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng))寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2.2 脾細(xì)胞培養(yǎng)分別于感染后第0、3、5、8、10、12、15天，常規(guī)無(wú)菌取出小鼠脾臟，用RPMI 1640培養(yǎng)液制備濃度為1×107個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，－80℃保存，待IFN-γ和IL-4檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測(cè)IFN-γ和IL-4產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1LS軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的凋亡數(shù)量取binding buffer制備的1×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液0.1 mL，加入流式細(xì)胞儀專用染色管中，每份樣品設(shè)陰性對(duì)照管、CD4-FITC單標(biāo)及其Annexin V-PE單標(biāo)管，另一管加入抗CD4-FITC和AnnexinV-PE各5 μL。25℃避光孵育15 min，每管加binding buffer 400 μL，1 h內(nèi)上機(jī)。利用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)B＆D公司)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，利用FACS CELLQUEST軟件獲取細(xì)胞，每個(gè)樣品分析10000個(gè)細(xì)胞，使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細(xì)胞群，以陰性對(duì)照為參考，將對(duì)照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點(diǎn)陣圖顯示，記錄CD4+T細(xì)胞凋亡的百分率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，各組之間指標(biāo)的差異性檢驗(yàn)選用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種瘧原蟲感染小鼠的原蟲血癥水平及生存率

P.y17XL和P.c AS感染小鼠分別于感染后第2天和第4天，外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞。隨后，P.y17XL感染小鼠原蟲血癥水平迅速持續(xù)升高，感染后第5天達(dá)峰值約60%，小鼠于感染后第5天及次日全部死亡;相比，P.c AS感染小鼠原蟲血癥水平上升緩慢，感染后第8天達(dá)到峰值僅為41%左右，隨后迅速下降，于感染后第14～16天自愈，小鼠生存率為100%(見圖1)。

2.2 兩種瘧原蟲感染小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4水平檢測(cè)

P.y17XL感染小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ水平僅在感染后第3天出現(xiàn)一過(guò)性有意義的升高(P＜0.01)，隨后迅速下降;P.c AS感染小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ水平在感染后第3天出現(xiàn)有意義升高，第5天達(dá)峰值(P＜0.01)，隨后下降至正常水平(見圖2)。P.y17XL感染小鼠脾細(xì)胞上清中IL-4水平僅在感染后第3天出現(xiàn)有意義升高(P＜0.05)，而P.c AS感染小鼠脾細(xì)胞上清中IL-4水平在感染后第8天出現(xiàn)有意義的升高，第10天達(dá)峰值(P＜0.01)，此后雖有回落但仍維持較高水平(見圖3)。

圖2 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平Fig.2The level of IFN-γ from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d)＊＊P＜0.01表示與正常對(duì)照組相比差異顯著

圖3 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4水平Fig.3The level of IL-4 from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points *P＜0.05 and＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d) *P＜0.05和＊＊P＜0.01表示與正常對(duì)照組相比差異顯著

2.3 兩種瘧原蟲感染小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量的檢測(cè)

P.y17XL感染小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量于感染后第3天出現(xiàn)有意義升高(P＜0.01)，于感染后5 d達(dá)到峰值(P＜0.01)。相比，P.c AS感染的小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量于感染后變化不明顯，僅于感染后第8天其數(shù)量和正常組小鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (圖4)。

圖4 不同瘧原蟲感染BALB/c小鼠后不同時(shí)間脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量變化Fig.4CD4+T cell apoptosis in P.y17XL or P.c AS-infected BALB/c mice

3 討論

關(guān)于紅內(nèi)期瘧原蟲感染的免疫機(jī)制，無(wú)論鼠瘧模型和人體試驗(yàn)研究結(jié)果均已證實(shí):CD4+T細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Thl-Th2連續(xù)活化是確保保護(hù)性免疫效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵［7-8］。Thl/Th2之間的平衡及協(xié)調(diào)不但能夠控制急性期的危象，而且最終能夠清除瘧原蟲。

本研究顯示在P.y17XL感染3 d后，BALB/c小鼠的原蟲血癥水平迅速持續(xù)上升，至感染后第5天高達(dá)60%，小鼠全部死亡，同時(shí)IFN-γ和IL-4分泌水平僅在感染后第3天出現(xiàn)一過(guò)性有意義的升高，而且峰值較低，這一結(jié)果提示BALB/c小鼠在瘧原蟲感染早期未能建立有效的Thl應(yīng)答控制紅內(nèi)期瘧原蟲的爆發(fā)性增殖，導(dǎo)致最終死亡的感染結(jié)局。與P.y17XL相比，P.c AS生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，所以宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)生長(zhǎng)快慢不同的瘧原蟲反應(yīng)就具有差異性［9］。BALB/c小鼠感染P.c AS，瘧原血癥于感染后第8天達(dá)到峰值僅為41%;IFN-γ分泌水平在感染后第5天達(dá)峰值，IL-4分泌水平在感染后第10天達(dá)峰值，且峰值較高維持時(shí)間較長(zhǎng)，小鼠全部存活，這一結(jié)果提示BALB/c能夠?qū).c AS建立有效地Th1型免疫應(yīng)答，并且成功地從Th1向Th2型應(yīng)答過(guò)渡。

外來(lái)抗原刺激CD4+T細(xì)胞活化、克隆增殖后，活化的T細(xì)胞通過(guò)活化誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡(AICD)方式及一種凋亡的形式完成免疫應(yīng)答中的使命。細(xì)胞活化后死亡是機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)的必要條件。然而細(xì)胞凋亡的數(shù)量或時(shí)相往往影響有效免疫應(yīng)答的建立或免疫記憶的維持［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，P.y17XL感染早期BLAB/c未建立有效的Th1應(yīng)答，同時(shí)伴隨CD4+T細(xì)胞大量凋亡，直至小鼠死亡;而P.c AS感染小鼠能夠建立有效地Th1型免疫應(yīng)答，并且Th1向Th2型應(yīng)答有序過(guò)渡，而凋亡細(xì)胞數(shù)量于感染后8 d出現(xiàn)有意義升高，小鼠全部存活。這一結(jié)果提示，P.y17XL感染的BALB/c小鼠未能建立有效的抗瘧應(yīng)答可能與CD4+T細(xì)胞凋亡過(guò)早或過(guò)度發(fā)生有關(guān)，而P.c AS感染的BALB/c小鼠正是由于CD4+T細(xì)胞的適宜凋亡而能建立有效的Th1免疫應(yīng)答，同時(shí)又有序過(guò)渡到Th2免疫應(yīng)答。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB/c小鼠感染不同瘧原蟲的免疫應(yīng)答模式和應(yīng)答效應(yīng)進(jìn)行了初步探討，再次證實(shí)Thl和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過(guò)渡對(duì)抵抗瘧疾感染至關(guān)重要，同時(shí)提示感染早期出現(xiàn)的大量細(xì)胞凋亡很可能使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)而不能建立有效的Th1應(yīng)答和Th1與Th2應(yīng)答的有序過(guò)渡，其相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。

［1］WHO:World Malaria Report，2010.vii年度報(bào)告.

［2］Feachem RG，Phillips AA，Hwang J，et al.Shrinking the malaria map:progress and prospects［J］.Lancet，2010，376(9752): 1566-1578.

［3］Schofield J，Grau GE.Immunological processes in malaria pathogenesis［J］.Nature Immunology，2005，5:722-735.

［4］Chen G，F(xiàn)eng H，Liu J，et al.Characterization of immune responses to single or mixed infections with P.yoelii 17XL and P.chabaudi AS in different strains of mice［J］.Parasitol Int，2010，59(3):400-406.

［5］Iriemenam NC，Okafor CM，Balogun HA，et al.Cytokine profiles and antibody responses to Plasmodium falciparum malaria infection in individuals living in Ibadan，southwest Nigeria［J］.Afr Health Sci，2009，9(2):66-74.

［6］Zheng W，Wang QH，Liu YJ，et al.Distinct host-related dendritic cell responses during the early stage of Plasmodium yoelii infection in susceptible and resistant mice［J］.Parasite Immunol，2010，32(5):324-334.

［7］Taylor Robinson AW，PhilliPs RS，Severn A，et al.The role of Thl and Th2 cells in a rodent malaria infection［J］.Seience，1993，260:1931-1934.

［8］Mathotra I，Mungai P，Muchiri E，et al.Distinct Thl and Th2 type prenatal cytokine responses to Plasmodium falciparum erythrocyte invasion ligands［J］.Infect Immun，2005，73:3462-3470.

［9］Cheesman S，Raza A，Carter R.Mixed strain infections and strain-s pecific protective immunity in the rodent malaria Parasite Plasmodium chabaudichabaudi in mice［J］.Infect Immun，2006，74:2996-3001.

［10］Freitas do Rosário AP，Muxel SM，et al.Gradual decline in malaria-specific memory T cell responses leads to failure to maintain long-term protective immunity to Plasmodium chabaudi AS despite persistence of B cell memory and circulating antibody［J］.J Immunol，2008，181(12):8344-8355.

［11］Mukherjee P，Devi YS，Chauhan VS.Blood stage malaria antigens induce different activation-induced cell death programs in splenic CD4+T cells［J］.Parasite Immunol，2008，30(10): 497-514.

Characteristic Comparison of CD4+Th Immune Responses and Apoptosis in BALB/c Mice Infected with Different Plasmodia

ZHENG Li1，SUN Xiao-dan2，PAN Yan-yan1，F(xiàn)ENG Hui1，CHEN Guang3，ZHOU Hong-xu1，CAO Ya-ming1
(1.Teach.＆Res.Div.of Immunol.，Coll.of Basic Med.，2.Basic Teach.Ctr.，Coll.of Clin.Med.，China Med.Uni.，Shenyang 110001; 3.Teach.＆Res.Div.of Parasotol.，Coll.of Basic Med.Jiamusi Uni.Jiamusi 154000)

Immune response characteristics in BALB/c mice infected with different plasmodia were investigated.BALB/c mice were infected by intraperitoneal injection with 1×106virulent P.yoelii 17XL or P.chabaudi AS parasitized erythrocytes，Splenocyte IFN-γ and IL-4 producing levels were measured by dynamic ELISA.The apoptosis of CD4+T cell was detected by flow cytometry.The results showed that during early stage of P.y 17XL infection，the parasitaemia of mice continuously increased and the secretion levels of IFN-γ and IL-4 appeared a transient significant increment only on d3 post-infection，though with low peak value;and a large number of CD4+T cells of spleen went apoptosis，and all mice died.However，the increment of parasitemia of mice infected with P.c AS was slow and the levels of IFN-γ reached to peak value on d5 post-infection，and IL-4 on d10 post-infection;And the time of peak value was maintained fairly long;a significant increment of the CD4+T cells of spleen apoptosis appeared d8 post-infection，and all mice survived.Therefore，protective immunity against malaria infection depended on the establishment of effective Th1 and Th2 responses and coordinative transition.The time phase and quantity of CD4+T apoptosis duringthe early infection might be a reason that affected the immune response strength and/or caused the immune of the host to inhibit，thereby affected the outcome of the host to infect the plasmodia.

BALB/c mice;Plasmodium yoelii;Plasmodium chabaudi;Th immune response，apoptosis

R392

A

1005－7021(2011)01－0019－05

國(guó)家自然科學(xué)基金(30800961)

鄭麗女，講師，博士研究生?，F(xiàn)從事抗感染免疫工作。E-mail:zli77@yahoo.com.cn

*通訊作者。Tel:024-23256666-5346，E-mail:yamingcao@yahoo.com.cn

2011-01-16;

2011-01-20