張 萬 忠， 杜 金 峰，， 王 云 山， 蘇 志 國，

（1．沈陽化工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142；

2．中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

玉米秸稈酶解條件優(yōu)化

張 萬 忠1， 杜 金 峰1，2， 王 云 山2， 蘇 志 國1，2

（1．沈陽化工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142；

2．中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

考察了玉米秸稈的酶解條件對纖維素酶解率的影響，分析了纖維素酶濃度、溫度、p H、酶解時(shí)間和固液比對玉米秸稈酶解的影響，比較了分批加酶和分批水解兩種方式的玉米秸稈纖維素酶解率。結(jié)果表明，采用纖維素酶水解玉米秸稈超細(xì)粉，對纖維素的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳酶解工藝條件為：加酶量30 U／g（對纖維素干重），固液比1∶10，溫度55℃，p H 4．8，酶解時(shí)間48 h；通過分批加酶和分批水解的方式可以提高酶解率，當(dāng)加酶3次和分批水解3次時(shí)，酶解率分別達(dá)到了33．42%和27．50%。

玉米秸稈；纖維素酶；酶解率

0 引 言

近年來，由于石油等一次性礦物資源的加速消耗以及環(huán)境污染的日益加劇，燃料乙醇作為安全、潔凈的燃料及汽油添加劑已經(jīng)倍受關(guān)注，燃料乙醇的需求量呈不斷上升的趨勢［1］。我國作為木質(zhì)纖維素生產(chǎn)大國，如將其與各種形式的木質(zhì)纖維素考慮其中，每年木質(zhì)纖維素產(chǎn)量高達(dá)10億噸，纖維素可被纖維素酶水解為葡萄糖等可發(fā)酵糖，通過發(fā)酵成為乙醇、丙酮等化工原料，實(shí)現(xiàn)植物纖維類物質(zhì)特別是農(nóng)業(yè)廢棄物的轉(zhuǎn)化利用研究，具有緩解能源危機(jī)，減少環(huán)境污染，維持人類可持續(xù)發(fā)展的意義［2］。

木質(zhì)纖維素原料的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，直接對其進(jìn)行糖化或生物轉(zhuǎn)化十分困難，為了提高木質(zhì)纖維素水解液葡萄糖的質(zhì)量濃度和酶解率，降低糖的損失，木質(zhì)纖維素的預(yù)處理是非常必要的［3］。預(yù)處理后需進(jìn)行纖維素的糖化，將纖維素水解糖化為葡萄糖等可發(fā)酵性糖類。常用的水解工藝包括酸水解工藝和酶水解工藝［4－5］。酸水解工藝需要加酸，反應(yīng)條件劇烈，對設(shè)備要求較高，具有較強(qiáng)的腐蝕性，易產(chǎn)生對微生物發(fā)酵有毒害作用的副產(chǎn)物，不利于后續(xù)的清潔燃料發(fā)酵研究，且回收酸需要花費(fèi)大量時(shí)間和成本。酶水解工藝反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，對環(huán)境污染小，不需要添加化學(xué)試劑，是較有發(fā)展前景的水解工藝。

目前，纖維素水解糖化最主要的問題是酶解效率低，酶解周期長，酶用量大，轉(zhuǎn)化率不高等方面，這些問題嚴(yán)重制約了木質(zhì)纖維原料的生物轉(zhuǎn)化和利用［6］。本實(shí)驗(yàn)通過對超細(xì)粉碎玉米秸稈酶水解過程中纖維素酶濃度、溫度、p H、酶解時(shí)間和固液比進(jìn)行研究，考察了玉米秸稈分批加酶和分批水解對酶解率的影響，為玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)清潔燃料的工藝優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米秸稈：產(chǎn)自北京郊區(qū)，將自然風(fēng)干的玉米秸稈切成3～4 cm長段，并放入超細(xì)粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后為100～200目秸稈粉。

纖維素酶：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，濾紙酶活為 83 U／m L，酶活定義為［7］：在 50 ℃、p H 4．8條件下，每分鐘水解1 cm×6 cm的濾紙，產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需酶量為1酶活單位。

1．2 儀器與設(shè)備

TS－2102新型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；Anke TGL－16C臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SBA－40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取處理后的干燥玉米秸稈粉，按照一定的固液比置于250 m L三角瓶中，調(diào)節(jié)底物混合物的p H，加入一定量的纖維素酶，在轉(zhuǎn)速為100 r／min的搖床中振蕩水解，每隔12 h取樣離心，測定葡萄糖含量，直至葡萄糖含量增加緩慢。

1．4 分析方法

葡萄糖的測定采用生物傳感儀分析法［8］。纖維素酶解率按下式計(jì)算［9］：

式中，m0和m1為水解后葡萄糖的質(zhì)量（g）和秸稈干重（g）；w1為纖維素所占秸稈干重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 加酶量對玉米秸稈酶解的影響

在木質(zhì)纖維素的酶法水解工藝中，纖維素酶的成本是決定酶解能否經(jīng)濟(jì)可行的關(guān)鍵因素［10］，降低纖維素酶的成本有兩個(gè)方面：降低纖維素酶的生產(chǎn)成本或是盡可能減少纖維原料酶解過程中纖維素酶的用量，因此確定纖維素的酶量十分重要。本實(shí)驗(yàn)選擇超細(xì)粉碎秸稈，在底物濃度1∶10固液比條件下，研究了每克纖維素分別加入5、10、20、30、40、50和60 U 對酶解的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 加酶量對玉米秸稈酶解的影響Fig．1 Effect of cellulase concentration on enzymatic hydrolysis of corn stover

從圖1可以看出，隨著加酶量的增大，纖維素酶解率持續(xù)增加，在加酶量為30 U／g纖維素時(shí)，酶解率為25．23%。加酶量大于30 U／g纖維素干重時(shí)，隨著纖維素酶濃度的增大，酶解率增長緩慢，說明當(dāng)纖維素酶分子達(dá)到一定水平時(shí)，纖維素酶可觸及纖維素的位點(diǎn)接近飽和，再加入纖維素酶酶解率增長緩慢。為了經(jīng)濟(jì)有效的利用纖維素酶，選擇纖維素酶量為30 U／g纖維素。

2．2 溫度對玉米秸稈酶解的影響

選擇45、50、55和60℃4個(gè)溫度梯度，酶解48 h，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對玉米秸稈酶解的影響Fig．2 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of corn stover

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，纖維素酶解率逐漸升高，在溫度為55℃時(shí)，酶解率達(dá)到最高，為22．71%。而隨著溫度的繼續(xù)增加，葡萄糖酶解率呈下降趨勢，說明纖維素酶在溫度過高和過低時(shí)都不能完全發(fā)揮它的作用，溫度過低纖維素酶不能完全利用，溫度過高則纖維素酶遭到破壞，發(fā)生不可逆性失活，酶活力降低，使纖維素水解玉米秸稈酶解率降低，所以纖維素酶水解玉米秸稈的最佳溫度為55℃。

2．3 pH對玉米秸稈酶解的影響

纖維素酶的活性受其環(huán)境p H的影響，一般纖維素酶的最適p H在4．4～5．0，本實(shí)驗(yàn)將p H設(shè)為4．2、4．5、4．8、5．1、5．4共5個(gè)梯度來觀察p H對玉米秸稈酶解的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對玉米秸稈酶解的影響Fig．3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of corn stover

由圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)p H對玉米秸稈酶解的影響并不十分明顯，隨著p H的增大，纖維素酶解率逐漸增加，在p H增大到4．8時(shí)，酶解率達(dá)到最大值，為24．32%。p H大于4．8時(shí)酶解率有所降低，說明在玉米秸稈水解液過酸或過堿的情況下，都會(huì)使纖維素酶失活，因?yàn)樵诿阜肿拥幕钚圆课簧暇哂泻芏嗨嵝曰驂A性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，可隨著p H的變化而發(fā)生解離，因此本實(shí)驗(yàn)將玉米秸稈酶解的最適p H設(shè)為4．8。

2．4 酶解時(shí)間對玉米秸稈酶解的影響

纖維素酶水解過程復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)選擇底物濃度固液比為1∶10，p H為4．8，考察了酶解時(shí)間對纖維素酶解率的影響，如圖4所示。由圖4可見，隨著玉米秸稈酶解時(shí)間的延長，纖維素酶解率持續(xù)增加，在前12 h酶解率增加較快，12 h后酶解率開始增加緩慢，48 h酶解率達(dá)到了22．65%，60 h時(shí)酶解率為23%，酶解時(shí)間從48 h增加到60 h，酶解率僅增加了1．55%。因?yàn)樵谒膺^程中，纖維素非結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)首先被纖維素酶水解，隨著水解的進(jìn)行，其所占的比例逐漸減小，導(dǎo)致纖維素酶解率增加緩慢，酶解率在48 h后增加緩慢，所以選擇酶解時(shí)間為48 h。

圖4 酶解時(shí)間對玉米秸稈酶解的影響Fig．4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of corn stover

2．5 固液比對玉米秸稈酶解的影響

固液比直接影響到底物濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度及纖維素酶分子濃度，因而對酶水解具有極為重要的影響。本實(shí)驗(yàn)將初始固液比設(shè)置為0．5∶10、1．0∶10、1．5∶10、2．0∶10，酶解48 h，結(jié)果如圖5所示。

圖5 固液比對玉米秸稈酶解的影響Fig．5 Effect of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis of corn stover

從圖5可以看出，隨著固液比的增大，葡萄糖質(zhì)量濃度逐漸增加，纖維素酶解率逐漸降低。固液比較小時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度較低，用于后續(xù)發(fā)酵時(shí)濃縮倍數(shù)較大，導(dǎo)致不利于菌種生長的抑制物濃度增大，影響后續(xù)發(fā)酵；而提高固液比雖有助于獲得較高的葡萄糖質(zhì)量濃度，但水解液中秸稈濃度過大，產(chǎn)生的攪拌和傳質(zhì)阻力增大，不利于酶與纖維素的結(jié)合，酶解率降低。綜合考慮葡萄糖質(zhì)量濃度、酶解率和對后續(xù)發(fā)酵的影響，選擇最佳固液比1∶10，此時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度為8．32 g／L，酶解率為24．1%。

2．6 分批加酶對玉米秸稈酶解的影響

在纖維素酶解過程中，由于纖維素酶活力的降低和纖維素酶與木質(zhì)素吸附等所造成的消耗，需要中途補(bǔ)充纖維素酶，以使纖維素充分水解，本實(shí)驗(yàn)考察分批加入纖維素酶對玉米秸稈酶解的影響，每48 h加酶一次，加4次，結(jié)果如圖6所示。

圖6 分批加酶對玉米秸稈酶解的影響Fig．6 Effect of fed－batch enzyme on enzymatic hydrolysis of corn stover

從圖6可以看出，葡萄糖質(zhì)量濃度和纖維素酶解率隨著加酶次數(shù)的增加而增加，隨著酶解過程中纖維素的水解和纖維素酶的加入，未水解纖維素所占比例逐漸減少；同時(shí)纖維素酶與纖維素接觸位點(diǎn)逐漸達(dá)到飽和，在加酶3次，酶解時(shí)間72 h時(shí)，酶解率和葡萄糖質(zhì)量濃度分別達(dá)到了33．42%和11．55 g／L。

2．7 分批水解對玉米秸稈酶解的影響

為了將纖維素完全水解，提高纖維素水解的酶解率，將玉米秸稈酶解后離心，再將水解殘?jiān)凑展桃罕?∶10的比例進(jìn)行水解，依次水解4次，結(jié)果如圖7所示。

圖7 分批水解對玉米秸稈酶解的影響Fig．7 Effect of fed－batch hydrolysis on enzymatic hydrolysis of corn stover

從圖7可以看出，隨著水解次數(shù)的增多，酶解率逐漸增加，分批水解前3次酶解率增加顯著，第3次酶解率達(dá)到了27．50%，在第4次水解過程中，酶解率增加量較少，僅增加了0．11%，說明超細(xì)秸稈在3次水解后不會(huì)再有葡萄糖的產(chǎn)生。

3 結(jié) 論

通過對玉米秸稈超細(xì)粉酶解條件的研究，確定了一種最佳酶解工藝條件，并考察了玉米秸稈超細(xì)粉的最高酶解率。

（1）通過對超細(xì)粉碎玉米秸稈酶解條件的工藝優(yōu)化，確定了酶解的最佳工藝條件：加酶量為30 U／g（對纖維素干重），固液比為1∶10，溫度為55℃，p H為4．8，酶解時(shí)間為48 h。

（2）選擇超細(xì)玉米秸稈，采用分批加酶和分批水解的方式得到較高的酶解率，在加酶3次和分批水解3次時(shí)纖維素酶解率分別達(dá)到了33．42%和27．50%，得出通過分批加酶的方法得到的酶解率較高。

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Enzymatic hydrolysis of corn straw

ZHANG Wan－zhong1， DU Jin－feng1，2， WANG Yun－shan2， SU Zhi－guo2
（1．College of Environment and Biology，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142，China；
2．State Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）

The effect of cellulase concentration，temperature，p H，reaction time and solid－liquid ratio on hydrolysis rate was studied and the hydrolysis rate of batch feed enzyme and batch enzymatic hydrolysis was compared．The optimum condition was 30 U／g cellulase，1∶10 of liquid－solid ratio，55℃，p H 4．8 for 48 h．Both batch feed enzyme and batch enzymatic hydrolysis could improve hydrolytic rate．Hydrolytic rate could reached to 33．42%and 27．50%，respectively after third feeding cellulase enzymatic and batch enzymatic hydrolysis three times．

corn straw；cellulase；enzymolysis rate

TS210．9；TK6

A

1674－1404（2011）06－0436－04

2011－04－11．

中科院知識(shí)創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目（KSCX1－YW－11D2）．

張萬忠（1968－），男，教授．