王冬敏 林健雄 彭東東 李進(jìn)展 李耿聰 李鴻檳 陳蕊明

吡嗪酰胺是一種重要的一線抗癆藥物，由于其可殺滅酸性巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）和半休眠菌，可使結(jié)核病的復(fù)發(fā)率大大下降，在現(xiàn)代結(jié)核病控制策略中廣泛應(yīng)用于短程化療方案，幾乎100%的新發(fā)結(jié)核病患者開始治療時(shí)都使用吡嗪酰胺，因此耐吡嗪酰胺的Mtb也越來(lái)越多，據(jù)文獻(xiàn)［1]統(tǒng)計(jì)為5.8%～18.6%，特別是近年來(lái)吡嗪酰胺的耐藥率明顯上升，甚至有些國(guó)家和地區(qū)報(bào)道的吡嗪酰胺耐藥率高達(dá)50.9%［2]。藥物敏感度試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)臨床第一線科學(xué)用藥的重要手段之一。大多數(shù)藥敏試驗(yàn)都可以在pH中性的常規(guī)培養(yǎng)基上順利進(jìn)行，但吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)例外，由于吡嗪酰胺僅在pH為5.5的酸性條件下才能轉(zhuǎn)化為殺菌的吡嗪酸，而Mtb在酸性條件下生長(zhǎng)很差，甚至不生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直是實(shí)驗(yàn)室中的一個(gè)難題。過(guò)去吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直沿用酸羅氏法，但由于羅氏培養(yǎng)基中所含蛋白質(zhì)對(duì)藥物有吸附作用，且在酸性條件下，Mtb生長(zhǎng)緩慢，甚至不生長(zhǎng)，從而使酸羅氏法耗時(shí)長(zhǎng)，需3～4周，而且結(jié)果不夠穩(wěn)定，可靠性差，已不能完全適應(yīng)臨床快速敏感試驗(yàn)的要求［3－4]，因而目前我國(guó)的大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有常規(guī)開展吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)。國(guó)外經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家通常使用BACTEC MGIT－960、BacT／ALERT 3D 儀器的快速培養(yǎng)方法，但成本昂貴，制約了其推廣應(yīng)用。為了更好地指導(dǎo)臨床對(duì)吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)方法，以解決這一長(zhǎng)期困擾臨床治療的難題。本研究應(yīng)用顆粒顯色指示法測(cè)定102株Mtb的吡嗪酰胺耐藥性，并與BACTEC MGIT－960法結(jié)果進(jìn)行比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

一、材料

1.待測(cè)菌株：102株 Mtb臨床分離株均選自汕頭市結(jié)核病防治所2011年3—5月結(jié)核病患者的標(biāo)本BACTEC MGIT－960初培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，經(jīng)抗酸染色確認(rèn)為抗酸桿菌，并經(jīng)常規(guī)生化反應(yīng)鑒定為Mtb。

2.細(xì)菌生長(zhǎng)指示管（bacterial growth indicator tube，BGIT）：含0.075g氧化還原指示顆粒，用于指示微生物的繁殖（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01010242710.7），批號(hào)：20101026；通用增菌培養(yǎng)基：含有 Middlebrook7H9營(yíng)養(yǎng)肉湯、牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營(yíng)養(yǎng)成分（注冊(cè)號(hào)：滬食藥監(jiān)（準(zhǔn)）2011第1400182號(hào)），為滿足吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)要求，通用增菌培養(yǎng)基的pH已調(diào)整至最佳（pH 6.0～6.1之間），批號(hào)：20101012；吡嗪酰胺藥物：含量為2000μg／ml；由上海積彩醫(yī)療器械有限公司提供。

3.BACTEC MGIT－960吡嗪酰胺藥敏專用分枝桿菌生長(zhǎng)指示管、藥敏試劑及960系統(tǒng)，由美國(guó)BD公司提供。

二、方法

對(duì)以上待測(cè)菌株同步進(jìn)行顆粒指示顯色法和BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實(shí)驗(yàn)，操作均在Ⅱ級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。

1.顆粒指示顯色法：（1）取2支細(xì)菌生長(zhǎng)指示管，在標(biāo)簽處標(biāo)記標(biāo)本號(hào)，其中1支標(biāo)注為1／10參照，另1支標(biāo)注為藥敏管。（2）取1管4.9ml通用增菌培養(yǎng)基，用吸槍各精確吸取2ml培養(yǎng)液加入到細(xì)菌生長(zhǎng)指示管中，余下含0.9ml培養(yǎng)液的管標(biāo)注為稀釋管。（3）吸0.1ml吡嗪酰胺藥物加入藥敏管，使藥敏管中藥物的最終濃度為100μg／ml。（4）菌液標(biāo)本取自BACTEC MGIT－960儀器提示陽(yáng)性不超過(guò)24h的培養(yǎng)管，用吸槍反復(fù)吹打均勻后，吸取0.1ml菌液加入稀釋管，經(jīng)充分混勻后吸0.1ml稀釋液加入1／10參照管；吸0.1ml原菌液加入藥敏管。（5）接種后置37℃培養(yǎng)，每天取出觀察生長(zhǎng)指示管。當(dāng)參照管出現(xiàn)紫色顆粒時(shí)判斷結(jié)果，藥敏管無(wú)紫色顆粒或紫色顆粒少于對(duì)照管判定為敏感，藥敏管中紫色顆粒多于或等同于參照管時(shí)判定為耐藥。結(jié)果判定方法見(jiàn)圖1。

圖1 吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定示意圖

2.BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實(shí)驗(yàn)按BACTEC MGIT－960操作手冊(cè)進(jìn)行，由儀器讀取報(bào)告結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏結(jié)果比較（表1）

兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為敏感67株，均為耐藥30株，總符合率為95.1%（97／102）。5株菌株兩種方法檢測(cè)結(jié)果不符，其中3株顆粒顯色指示法測(cè)定為敏感，BACTEC MGIT－960法測(cè)定為耐藥；2株為顆粒顯色指示法耐藥，BACTEC MGIT－960法檢測(cè)為敏感。如以BACTEC MGIT－960法測(cè)定吡嗪酰胺耐藥性結(jié)果為考核標(biāo)準(zhǔn)，則顆粒顯色指示法檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的敏感度為90.9%（30／33），特異度 為 97.1% （67／69），陽(yáng) 性 預(yù) 測(cè) 值 為 93.8%（30／32），陰性預(yù)測(cè)值為95.7%（67／70），準(zhǔn)確性為95.1%（97／102）。

二、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏報(bào)告時(shí)間比較

結(jié)果顯示顆粒顯色指示法出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最早時(shí)間是7d，最晚時(shí)間為14d，平均（9.47±1.66）d；BACTEC MGIT－960法出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最早時(shí)間是6d，最晚時(shí)間為13d，平均（9.33±1.77）d，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.573，P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

表1 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏結(jié)果比較（株）

表2 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏報(bào)告時(shí)間比較

討 論

吡嗪酰胺是治療結(jié)核病最有效的一線藥物中的重要藥物，該藥物于1940年由Hall等在合成氨基吡啶過(guò)程中作為一種中間化合物首次被合成［5]，它的抗結(jié)核菌活性于1952年被Yeager等發(fā)現(xiàn)。但其與利福平和異煙肼聯(lián)用治療結(jié)核病顯著縮短化療時(shí)間的獨(dú)特作用是在其用于治療結(jié)核病29年之后的1981年才見(jiàn)報(bào)道［6]。吡嗪酰胺用于治療結(jié)核病至今已有半個(gè)世紀(jì)，其抗菌機(jī)制為：吡嗪酰胺是一種煙酰胺類似物，與異煙肼相似也是一種抗Mtb的原藥，但其發(fā)揮作用所要求的環(huán)境不同，吡嗪酰胺需要在酸性環(huán)境才表現(xiàn)抗菌活性且最低抑菌濃度（MIC）與pH值在7.0以下存在很好的正相關(guān)性［7]。吡嗪酰胺通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入Mtb細(xì)胞內(nèi)，在Mtb細(xì)胞內(nèi)由吡嗪酰胺酶（PZase）將其轉(zhuǎn)化為具有抗Mtb活性形式的吡嗪酸，所以PZase活性對(duì)吡嗪酰胺表現(xiàn)抗Mtb活性是必需的，眾多的研究結(jié)果支持pncA基因的突變?cè)斐蒔Zase活性降低或喪失是Mtb產(chǎn)生對(duì)吡嗪酰胺耐藥的主要原因，隨著研究的深入，亦有很多研究結(jié)果表明，并不是所有耐藥菌株都存在pncA基因突變，大約70%的吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA基因突變，而且pncA基因存在突變但PZase還保持活性，因而目前通過(guò)基因檢測(cè)的手段檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的方法尚未成熟［8]。

目前，檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的方法主要有用羅氏培養(yǎng)基的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)、快速培養(yǎng)儀檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于吡嗪酰胺在體外酸性環(huán)境中才能表現(xiàn)出抗菌活性，而Mtb在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)不良，使得常規(guī)方法測(cè)定吡嗪酰胺的耐藥性存在一定困難，而且耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性差。從而導(dǎo)致吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直是實(shí)驗(yàn)室中的一個(gè)難題，中國(guó)防癆協(xié)會(huì)2009年出版的《結(jié)核診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》里亦沒(méi)有頒布吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速，但操作繁瑣，且突變檢出率偏低，pncA基因檢測(cè)法在3種方法中最快速，可彌補(bǔ)常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足，但國(guó)內(nèi)王金河等［4]的研究報(bào)道與酸羅氏法的符合率為75%，符合70%左右的吡嗪酰胺耐藥株存在pncA基因突變這一耐藥分子機(jī)制，但仍有30%左右的菌株不能用此方法正確地鑒定出。BACTEC MGIT－960快速培養(yǎng)儀具有美國(guó)FDA認(rèn)證的一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家通常作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但其吡嗪酰胺耐藥性測(cè)定需要專用的培養(yǎng)基和配套試劑，費(fèi)用特別昂貴，價(jià)格幾乎相當(dāng)于其他4種一線藥物的總和，限制了它的推廣應(yīng)用。因此，快速、簡(jiǎn)便、靈敏的吡嗪酰胺耐藥性測(cè)定技術(shù)研究是國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注的課題，為了更好的指導(dǎo)臨床對(duì)吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)方法。國(guó)內(nèi)匡鐵吉教授在20世紀(jì)80年代研制的匡氏瓊脂培養(yǎng)基吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)，能在3周左右報(bào)告結(jié)果，與酸羅氏法符合率為100%［4]；上海市結(jié)核重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究了吡嗪酰胺耐藥性Mtb的噬菌體檢測(cè)技術(shù)，可以在3d內(nèi)報(bào)告結(jié)果，與酸羅氏法比較準(zhǔn)確性達(dá)到91.7［9]，因?qū)Ρ确椒ǖ牟煌?，本研究未與上述方法進(jìn)行比較。

建立Mtb的吡嗪酰胺耐藥性的方法，必須解決2個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，一是吡嗪酰胺作用所需的酸性環(huán)境與Mtb在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)不良的問(wèn)題，二是如何快速簡(jiǎn)便指示細(xì)菌生長(zhǎng)。本研究使用的手工操作的顆粒顯色指示液體培養(yǎng)系統(tǒng)，通用液體培養(yǎng)基含有營(yíng)養(yǎng)豐富Middlebrook7H9營(yíng)養(yǎng)肉湯和牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營(yíng)養(yǎng)成分，并且使用0.1mol的鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0～6.1之間，可以很好地解決Mtb生長(zhǎng)和吡嗪酰胺作用的問(wèn)題。細(xì)菌生長(zhǎng)指示管（BGIT），采用新型的氧化還原反應(yīng)顯色指示劑，當(dāng)有活的Mtb存在，則顆粒還原為紫紅色，顯色快，長(zhǎng)時(shí)間保持顏色穩(wěn)定不變，大大提高了結(jié)果的可靠性，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可為臨床及時(shí)提供結(jié)果。本研究中顆粒顯色指示法最早報(bào)告結(jié)果的時(shí)間比BACTEC MGIT－960法稍晚一天左右，主要集中在第8、9、10天出結(jié)果，二者的生長(zhǎng)速度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且其耗材成本略高于酸羅氏法而遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BACTEC MGIT－960法。總之，本研究利用顆粒顯色指示法檢測(cè)Mtb臨床分離株對(duì)吡嗪酰胺的耐藥性，跟BACTEC MGIT－960法比較，有較高的敏感度和特異度，結(jié)果報(bào)告時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是一種快速、敏感、操作簡(jiǎn)便，與標(biāo)準(zhǔn)方法符合率高的藥敏試驗(yàn)方法。鑒于實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少，筆者期盼著通過(guò)不同研究者的反復(fù)論證和不同實(shí)驗(yàn)室的反復(fù)試驗(yàn)，最終能為吡嗪酰胺的耐藥性提供一種快速檢測(cè)手段。

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