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        顆粒顯色指示技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)吡嗪酰胺耐藥性的價(jià)值

        2011-09-20 09:58:42王冬敏林健雄彭東東李進(jìn)展李耿聰李鴻檳陳蕊明
        中國(guó)防癆雜志 2011年9期
        關(guān)鍵詞:耐藥檢測(cè)方法

        王冬敏 林健雄 彭東東 李進(jìn)展 李耿聰 李鴻檳 陳蕊明

        吡嗪酰胺是一種重要的一線抗癆藥物,由于其可殺滅酸性巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)和半休眠菌,可使結(jié)核病的復(fù)發(fā)率大大下降,在現(xiàn)代結(jié)核病控制策略中廣泛應(yīng)用于短程化療方案,幾乎100%的新發(fā)結(jié)核病患者開始治療時(shí)都使用吡嗪酰胺,因此耐吡嗪酰胺的Mtb也越來(lái)越多,據(jù)文獻(xiàn)[1]統(tǒng)計(jì)為5.8%~18.6%,特別是近年來(lái)吡嗪酰胺的耐藥率明顯上升,甚至有些國(guó)家和地區(qū)報(bào)道的吡嗪酰胺耐藥率高達(dá)50.9%[2]。藥物敏感度試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)臨床第一線科學(xué)用藥的重要手段之一。大多數(shù)藥敏試驗(yàn)都可以在pH中性的常規(guī)培養(yǎng)基上順利進(jìn)行,但吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)例外,由于吡嗪酰胺僅在pH為5.5的酸性條件下才能轉(zhuǎn)化為殺菌的吡嗪酸,而Mtb在酸性條件下生長(zhǎng)很差,甚至不生長(zhǎng),從而導(dǎo)致吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直是實(shí)驗(yàn)室中的一個(gè)難題。過(guò)去吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直沿用酸羅氏法,但由于羅氏培養(yǎng)基中所含蛋白質(zhì)對(duì)藥物有吸附作用,且在酸性條件下,Mtb生長(zhǎng)緩慢,甚至不生長(zhǎng),從而使酸羅氏法耗時(shí)長(zhǎng),需3~4周,而且結(jié)果不夠穩(wěn)定,可靠性差,已不能完全適應(yīng)臨床快速敏感試驗(yàn)的要求[3-4],因而目前我國(guó)的大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有常規(guī)開展吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)。國(guó)外經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家通常使用BACTEC MGIT-960、BacT/ALERT 3D 儀器的快速培養(yǎng)方法,但成本昂貴,制約了其推廣應(yīng)用。為了更好地指導(dǎo)臨床對(duì)吡嗪酰胺的使用,有必要研究開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)方法,以解決這一長(zhǎng)期困擾臨床治療的難題。本研究應(yīng)用顆粒顯色指示法測(cè)定102株Mtb的吡嗪酰胺耐藥性,并與BACTEC MGIT-960法結(jié)果進(jìn)行比較,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

        材料和方法

        一、材料

        1.待測(cè)菌株:102株 Mtb臨床分離株均選自汕頭市結(jié)核病防治所2011年3—5月結(jié)核病患者的標(biāo)本BACTEC MGIT-960初培養(yǎng)陽(yáng)性菌株,經(jīng)抗酸染色確認(rèn)為抗酸桿菌,并經(jīng)常規(guī)生化反應(yīng)鑒定為Mtb。

        2.細(xì)菌生長(zhǎng)指示管(bacterial growth indicator tube,BGIT):含0.075g氧化還原指示顆粒,用于指示微生物的繁殖(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01010242710.7),批號(hào):20101026;通用增菌培養(yǎng)基:含有 Middlebrook7H9營(yíng)養(yǎng)肉湯、牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營(yíng)養(yǎng)成分(注冊(cè)號(hào):滬食藥監(jiān)(準(zhǔn))2011第1400182號(hào)),為滿足吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)要求,通用增菌培養(yǎng)基的pH已調(diào)整至最佳(pH 6.0~6.1之間),批號(hào):20101012;吡嗪酰胺藥物:含量為2000μg/ml;由上海積彩醫(yī)療器械有限公司提供。

        3.BACTEC MGIT-960吡嗪酰胺藥敏專用分枝桿菌生長(zhǎng)指示管、藥敏試劑及960系統(tǒng),由美國(guó)BD公司提供。

        二、方法

        對(duì)以上待測(cè)菌株同步進(jìn)行顆粒指示顯色法和BACTEC MGIT-960法吡嗪酰胺藥敏實(shí)驗(yàn),操作均在Ⅱ級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。

        1.顆粒指示顯色法:(1)取2支細(xì)菌生長(zhǎng)指示管,在標(biāo)簽處標(biāo)記標(biāo)本號(hào),其中1支標(biāo)注為1/10參照,另1支標(biāo)注為藥敏管。(2)取1管4.9ml通用增菌培養(yǎng)基,用吸槍各精確吸取2ml培養(yǎng)液加入到細(xì)菌生長(zhǎng)指示管中,余下含0.9ml培養(yǎng)液的管標(biāo)注為稀釋管。(3)吸0.1ml吡嗪酰胺藥物加入藥敏管,使藥敏管中藥物的最終濃度為100μg/ml。(4)菌液標(biāo)本取自BACTEC MGIT-960儀器提示陽(yáng)性不超過(guò)24h的培養(yǎng)管,用吸槍反復(fù)吹打均勻后,吸取0.1ml菌液加入稀釋管,經(jīng)充分混勻后吸0.1ml稀釋液加入1/10參照管;吸0.1ml原菌液加入藥敏管。(5)接種后置37℃培養(yǎng),每天取出觀察生長(zhǎng)指示管。當(dāng)參照管出現(xiàn)紫色顆粒時(shí)判斷結(jié)果,藥敏管無(wú)紫色顆粒或紫色顆粒少于對(duì)照管判定為敏感,藥敏管中紫色顆粒多于或等同于參照管時(shí)判定為耐藥。結(jié)果判定方法見(jiàn)圖1。

        圖1 吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定示意圖

        2.BACTEC MGIT-960法吡嗪酰胺藥敏實(shí)驗(yàn)按BACTEC MGIT-960操作手冊(cè)進(jìn)行,由儀器讀取報(bào)告結(jié)果。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,采用t檢驗(yàn),以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT-960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏結(jié)果比較(表1)

        兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為敏感67株,均為耐藥30株,總符合率為95.1%(97/102)。5株菌株兩種方法檢測(cè)結(jié)果不符,其中3株顆粒顯色指示法測(cè)定為敏感,BACTEC MGIT-960法測(cè)定為耐藥;2株為顆粒顯色指示法耐藥,BACTEC MGIT-960法檢測(cè)為敏感。如以BACTEC MGIT-960法測(cè)定吡嗪酰胺耐藥性結(jié)果為考核標(biāo)準(zhǔn),則顆粒顯色指示法檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的敏感度為90.9%(30/33),特異度 為 97.1% (67/69),陽(yáng) 性 預(yù) 測(cè) 值 為 93.8%(30/32),陰性預(yù)測(cè)值為95.7%(67/70),準(zhǔn)確性為95.1%(97/102)。

        二、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT-960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏報(bào)告時(shí)間比較

        結(jié)果顯示顆粒顯色指示法出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最早時(shí)間是7d,最晚時(shí)間為14d,平均(9.47±1.66)d;BACTEC MGIT-960法出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最早時(shí)間是6d,最晚時(shí)間為13d,平均(9.33±1.77)d,兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.573,P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

        表1 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT-960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏結(jié)果比較(株)

        表2 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT-960法檢測(cè)吡嗪酰胺藥敏報(bào)告時(shí)間比較

        討 論

        吡嗪酰胺是治療結(jié)核病最有效的一線藥物中的重要藥物,該藥物于1940年由Hall等在合成氨基吡啶過(guò)程中作為一種中間化合物首次被合成[5],它的抗結(jié)核菌活性于1952年被Yeager等發(fā)現(xiàn)。但其與利福平和異煙肼聯(lián)用治療結(jié)核病顯著縮短化療時(shí)間的獨(dú)特作用是在其用于治療結(jié)核病29年之后的1981年才見(jiàn)報(bào)道[6]。吡嗪酰胺用于治療結(jié)核病至今已有半個(gè)世紀(jì),其抗菌機(jī)制為:吡嗪酰胺是一種煙酰胺類似物,與異煙肼相似也是一種抗Mtb的原藥,但其發(fā)揮作用所要求的環(huán)境不同,吡嗪酰胺需要在酸性環(huán)境才表現(xiàn)抗菌活性且最低抑菌濃度(MIC)與pH值在7.0以下存在很好的正相關(guān)性[7]。吡嗪酰胺通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入Mtb細(xì)胞內(nèi),在Mtb細(xì)胞內(nèi)由吡嗪酰胺酶(PZase)將其轉(zhuǎn)化為具有抗Mtb活性形式的吡嗪酸,所以PZase活性對(duì)吡嗪酰胺表現(xiàn)抗Mtb活性是必需的,眾多的研究結(jié)果支持pncA基因的突變?cè)斐蒔Zase活性降低或喪失是Mtb產(chǎn)生對(duì)吡嗪酰胺耐藥的主要原因,隨著研究的深入,亦有很多研究結(jié)果表明,并不是所有耐藥菌株都存在pncA基因突變,大約70%的吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA基因突變,而且pncA基因存在突變但PZase還保持活性,因而目前通過(guò)基因檢測(cè)的手段檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的方法尚未成熟[8]。

        目前,檢測(cè)吡嗪酰胺耐藥性的方法主要有用羅氏培養(yǎng)基的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)、快速培養(yǎng)儀檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于吡嗪酰胺在體外酸性環(huán)境中才能表現(xiàn)出抗菌活性,而Mtb在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)不良,使得常規(guī)方法測(cè)定吡嗪酰胺的耐藥性存在一定困難,而且耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性差。從而導(dǎo)致吡嗪酰胺的敏感試驗(yàn)一直是實(shí)驗(yàn)室中的一個(gè)難題,中國(guó)防癆協(xié)會(huì)2009年出版的《結(jié)核診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》里亦沒(méi)有頒布吡嗪酰胺的藥敏試驗(yàn)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速,但操作繁瑣,且突變檢出率偏低,pncA基因檢測(cè)法在3種方法中最快速,可彌補(bǔ)常規(guī)藥敏試驗(yàn)的不足,但國(guó)內(nèi)王金河等[4]的研究報(bào)道與酸羅氏法的符合率為75%,符合70%左右的吡嗪酰胺耐藥株存在pncA基因突變這一耐藥分子機(jī)制,但仍有30%左右的菌株不能用此方法正確地鑒定出。BACTEC MGIT-960快速培養(yǎng)儀具有美國(guó)FDA認(rèn)證的一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn),在發(fā)達(dá)國(guó)家通常作為標(biāo)準(zhǔn)方法,但其吡嗪酰胺耐藥性測(cè)定需要專用的培養(yǎng)基和配套試劑,費(fèi)用特別昂貴,價(jià)格幾乎相當(dāng)于其他4種一線藥物的總和,限制了它的推廣應(yīng)用。因此,快速、簡(jiǎn)便、靈敏的吡嗪酰胺耐藥性測(cè)定技術(shù)研究是國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注的課題,為了更好的指導(dǎo)臨床對(duì)吡嗪酰胺的使用,有必要研究開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、廉價(jià)的吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)方法。國(guó)內(nèi)匡鐵吉教授在20世紀(jì)80年代研制的匡氏瓊脂培養(yǎng)基吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn),能在3周左右報(bào)告結(jié)果,與酸羅氏法符合率為100%[4];上海市結(jié)核重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究了吡嗪酰胺耐藥性Mtb的噬菌體檢測(cè)技術(shù),可以在3d內(nèi)報(bào)告結(jié)果,與酸羅氏法比較準(zhǔn)確性達(dá)到91.7[9],因?qū)Ρ确椒ǖ牟煌?,本研究未與上述方法進(jìn)行比較。

        建立Mtb的吡嗪酰胺耐藥性的方法,必須解決2個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,一是吡嗪酰胺作用所需的酸性環(huán)境與Mtb在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)不良的問(wèn)題,二是如何快速簡(jiǎn)便指示細(xì)菌生長(zhǎng)。本研究使用的手工操作的顆粒顯色指示液體培養(yǎng)系統(tǒng),通用液體培養(yǎng)基含有營(yíng)養(yǎng)豐富Middlebrook7H9營(yíng)養(yǎng)肉湯和牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營(yíng)養(yǎng)成分,并且使用0.1mol的鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~6.1之間,可以很好地解決Mtb生長(zhǎng)和吡嗪酰胺作用的問(wèn)題。細(xì)菌生長(zhǎng)指示管(BGIT),采用新型的氧化還原反應(yīng)顯色指示劑,當(dāng)有活的Mtb存在,則顆粒還原為紫紅色,顯色快,長(zhǎng)時(shí)間保持顏色穩(wěn)定不變,大大提高了結(jié)果的可靠性,具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),可為臨床及時(shí)提供結(jié)果。本研究中顆粒顯色指示法最早報(bào)告結(jié)果的時(shí)間比BACTEC MGIT-960法稍晚一天左右,主要集中在第8、9、10天出結(jié)果,二者的生長(zhǎng)速度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且其耗材成本略高于酸羅氏法而遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BACTEC MGIT-960法。總之,本研究利用顆粒顯色指示法檢測(cè)Mtb臨床分離株對(duì)吡嗪酰胺的耐藥性,跟BACTEC MGIT-960法比較,有較高的敏感度和特異度,結(jié)果報(bào)告時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,是一種快速、敏感、操作簡(jiǎn)便,與標(biāo)準(zhǔn)方法符合率高的藥敏試驗(yàn)方法。鑒于實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少,筆者期盼著通過(guò)不同研究者的反復(fù)論證和不同實(shí)驗(yàn)室的反復(fù)試驗(yàn),最終能為吡嗪酰胺的耐藥性提供一種快速檢測(cè)手段。

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